Northern雜交試驗指導手冊
DIG標記的Northern雜交試驗指導
一、 RNA提取
方法一、改良異硫氰酸胍提取法
試劑及其配制
異硫氰酸胍變性液：
貯存液－在含484ml 水（經DEPC處理）, 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備用（不超過3個月）。
工作液－在每50ml貯存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室溫下保存不超過1個月。工作液各成分的終濃度為：
4mol/L異硫氰酸胍
25mol/L檸檬酸鈉pH 7.0
0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)
0.1mol/L巰基乙醇(2-ME)
其它溶液：
2mol/L乙酸鈉 (NaAc) 緩沖液 (pH 4.0)
水飽和酚（pH 3.5）
49∶1 (v/v) 氯仿/異戊醇
100%異丙醇
70%乙醇（用DEPC處理水配制）
DEPC處理后高壓滅菌水
試驗程序
1．取0.5~1g左右新鮮植物組織置于研缽中，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末。
2．將粉末全部移入冰上預冷的離心管中，并向其中加入5ml異硫氰酸胍變性液，輕輕搖動離心管使混合均勻。
3．順序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水飽和苯酚5ml、氯仿/異戊醇1ml，每加入一種試劑都輕輕搖動離心管混合均勻，最后將離心管蓋緊，倒轉幾次混合均勻，冰浴15min.。
4．4℃條件下15000g離心30min.，將上層水相轉移至另一干凈的離心管中，并加入等體積的異丙醇，混勻后置于－20℃冰箱冷凍1h.。
5．4℃條件下13000g離心25min.，小心去除上清液，沉淀溶于1.5ml異硫酸胍變型液中（體積為第一次變性液的1/3），再加入等體積的異丙醇，混勻后置于－20℃冰箱冷凍1h.。
6．4℃條件下13000g離心20min.，沉淀用70%乙醇洗一次，晾干后溶于適量體積（50μg/100μl）的DEPC處理水中，檢測后分裝，置于－70℃低溫條件下保存。
注意事項
RNA提取過程中，為了保證所提取的RNA的純度和完整性，其中有兩個方面的問題需要特別控制，一是去除與RNA結合的蛋白質，二避免內外源Rnase對RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白質變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉（SDS）等。為防止外源Rnase的污染，所有試驗用品均需用DEPC處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經DEPC處理過的水或滅菌處理。內源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強還原劑。為避免人體污染，所有試驗操作均應帶手套，避免人體接觸所有用品。
方法二、改良Krapp提取法
試劑及其配制
RNA抽提掖：
母液：4mol 異硫氰酸胍
20mmol EDTA
20mmol MES
pH 7.0