實驗概要
Omega真菌RNA提取試劑盒中文說明書(E.Z.N.A. Fungal RNA Kit)。
主要試劑
1. 取適量RB裂解液，按1ml裂解液加入20ul 2-疏基乙醇。該混合液可于室溫放置一周。
2. 用DEPC水配置一小瓶70%乙醇。
3. 按下表用無水乙醇稀釋RNA Wash Buffer II，并于室溫保存。
R6840-00: 加入8ml無水乙醇
R6840-01: 加入48ml無水乙醇
R6840-02: 每瓶加入48ml無水乙醇
實驗步驟
1. 稱取50-100mg經液氮研磨成粉末狀的真菌樣品至1. 5ml離心管，立即加入500ul RB/2-Me, 劇烈渦旋。
2. 室溫14,000×g離心5min，小心轉移上清至勻漿柱中。14,000×g離心2min。
3. 轉移收集管中的上清(注意不要吸到沉淀)至新離心管，加入0. 5倍體積無水乙醇或等體積的7 0 %乙醇，吸打或渦旋混勻。(一般可轉移450ul的上清液，可加入225ul無水乙醇)。
4. 把RNA柱套在新收集管，轉移混合液至RNA柱子。室溫10,000×g離心30-60秒，棄去濾液。如果出現堵柱現象，提高離心速度至14, 000xg。
5. (可選)膜上DNase消化:
1) 加入300ul RNA Wash Buffer I至柱子中，按上柱條件離心，棄濾液；
2) 配制DNase消化液( Digestion Buffer，73.5ul；RNase-Free DNase I，1.5ul)，混勻。
3) 將上述消化液轉移至柱子膜的正中央，不要將消化液轉移至柱子內壁。
4) 室溫靜置15分鐘。
6. 加入400ul RNA Wash Buffer I至柱子中，按以上條件離心，棄去濾液和收集管。
7. 把柱子套在新收集管，加入500ul RNA Wash Buffer II 至柱子，按以上條件離心棄去濾液。
8. 把柱子套回收集管，加入500ul RNA Wash Buffer II 至柱子，按以上條件離心棄去濾液。
9. 10,000xg離心空柱2min以上甩干柱子基質。
注意：不要忽略此步――這對從柱子上除去乙醇至關重要。
10. 把柱子裝在干凈的1.5ml離心管上，加入30- 50ul DEPC Water到柱子基質上室溫靜置2min。10,000xg離心2min洗脫出RNA。
