OsAGAP在擬南芥中的功能分析

實驗概要

本實驗對水稻小G蛋白ArfGTPase激活蛋白OsA GAP在擬南芥中的功能進行了分析，首先構建了OsAGAP在擬南芥中的正義表達載體，利用農桿菌介導的真空抽濾法轉化擬南芥，篩選擬南芥陽性苗，然后用組織PCR和 Southern雜交做了檢測。

實驗材料

1. 所用擬南芥((Arabidopsis thaliana)生態型為C24，22℃，16h光照培養。

2. 菌株：大腸桿菌：DH5α；農桿菌：GV3101等。

實驗步驟

1. OsAGAP在擬南芥中正義表達載體的構建

根據OsAGAP的cDNA序列設計5’端引物(F35XBASL)：5'-CT TCTAGA CCAGCC AGG AGA AAT CCA-3'(下劃線序列為XbaI位點)，3’端引物(F35BAMH3R)：5'-TT GGATCC ATCC AC AAA TGA ACC AAG TTA ACA-3'(下劃線序列為BamHI位點)，經XbaI/BamHI雙酶切消化后，以正向插入到pBI121載體相應位置構成pBI121-OsAGAP表達載體。

2. 農桿菌介導的真空抽濾法擬南芥轉化

   1) 農桿菌準備

      a. 接種含有表達載體的農桿菌克隆于5ml YEB培養基(含100ug/ml Rif，100ug/ml Kan)中，28℃，200rpm，振蕩培養過夜；

      b. 按1:50的比例轉接到200ml YEB培養基中，28℃，200rpm培養至OD₆₀₀為3.12-3.16:

      c. 5000g，離心15min，收集菌體；

      d. 重懸于滲透緩沖液(0.5XMS，5%蔗糖，0. 0396 Silwet L-77)，調OD*至0.8。

   2) 真空抽濾法轉化

將擬南芥培養缽倒置于裝有滲透緩沖液的合適大小的容器上，于干燥器中抽真空3-5min，緩慢放氣，取出培養缽側置于托盤中，用塑料薄膜覆蓋托盤，24h后取下薄膜，于溫室中繼續培養。

3. 擬南芥陽性苗篩選

   1) 將收獲的轉基因種子用0.2%的TritonX-100浸泡l0min；

   2) 再用10%的次氯酸鈉表面消毒，12min；

   3) 滅菌水洗滌五次，每2min一次；

   4) 用水將種子鋪在含50mg/L Kan的MS平板上，4℃黑暗培養兩天；

   5) 22℃，16h光照培養。經Kan篩選后仍然長勢良好，真葉葉片及生長點呈深綠色且根部伸扎入培養基的幼苗即可初步確定為陽性苗。

4. 組織PCR

   1) 1 X 1 mm的組織，加入40ul 0.25N NaOH煮沸30s；

   2) 加入40ul 0.25N HCl和20ul buffer(0.5M Tris-HCl，PH8.0，0.25% NP40)。煮沸2min，棄液體部分。

   3) 加50ul PCR反應混合物。

5. Southern雜交

   1) 30ug的植物總DNA用適量的限制性內切酶(1ug/5unit )酶切過夜；

   2) 取少量的酶切產物檢查酶切效果，酶切徹底的DNA在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳上電泳2-3hr；

   3) 凝膠在3.1.5 M NaCl和0.5 M NaOH變性45min；

   4) 切去凝膠的多余部分，通過毛細作用將DNA轉移至尼龍膜((Boehringer Mannheim)上，轉移buffer為20 X SSC；

   5) 轉膜結束后，將膜用3.15 M NaCI和Tris-HCl (pH7.4)中和buffer中和45min；

   6) 尼龍膜晾干后于80℃烘烤0.5 -2hr，真空保存；

   7) 雜交前，將尼龍膜在5 X SSC中浸透后，轉入預雜交液中，65℃下預雜交1-2hr；

   8) 探針隨機標記(亦可用PCR標記)：反應體系為50ul。(標記好的探針經過柱純化后在進行雜交，效果更佳)，反應前模板DNA熱變性10 min，冰浴迅速冷卻。反應時間為1 hr至過夜。

   模板    50 ng

   隨機引物    1 ul

   Klenow(5u/ul)    1 ul

   5 X BufFer    10ul

   ³²P-dCTP    5ul

   dATP    1ul

   dGTP    1ul

   dTTP    1 ul

   ddH₂O    至終體積50ul

   9) 預雜交結束后，加入³²P標記的DNA探針，65℃下雜交16-20 hr；

   10) 雜交結束后，分別在高鹽洗膜buffer(2 X SSC和0.5%SDS，室溫5min)和低鹽洗膜buffer(0.1 X SSC和0.5%SDS，65℃ 30min)下，各洗兩次；

   11) 晾干后，X-光膠片進行放射自顯影；

   12) -70℃曝光1-4天后，按常規洗片。

6. 掃描電鏡觀察

   1) 取莖尖于FAA (50%乙醇，5%乙酸，37%甲醛)，4℃固定2h；

   2) 梯度乙醇脫水，70%，85%，95%，最后換到100%乙醇中兩次；

   3) 二氧化碳臨界點干燥；

   4) 用雙面膠粘在金屬臺上，離子濺射儀對材料噴金、鍍膜；

   5) 掃描電鏡觀察。

7. 轉基因擬南芥生理試驗

將按上述方法篩選后的陽性苗轉移到含有各種生長素、TIBA的I/2MS培養基上，對萌發苗的初生根、不定根長度、側生根數目進行測量觀察。每組實驗設三個重復，每個重復共萌發10顆左右幼苗。