OsCCT1b抗體的制備

實驗概要

本實驗構建了含OsCCTlb的原核表達載體，獲陽性克隆。誘導表達純化后免疫兔子，制備了OsCCT1b抗體。

實驗步驟

1. 載體構建

將高保真PCR擴增的OsCRYlb基因的C末端OsCCTlb克隆到pET-21a( )載體中，得到的陽性克隆轉化如大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)。

2. 小量誘導

   1) 將質粒pET-21a( )-OsCCTlb轉入大腸桿菌BL21 (DE3)，得到轉化子。

   2) 挑取單克隆至含有Amp的LB液體培養基中，37℃ 220rpm培養過夜。取100uL過夜培養的菌液轉接到2mL新鮮的LB抗性培養基中，37℃ 220rpm培養至OD₆₀₀=0.5。

   3) 加入1M IPTG至終濃度為1 mM，繼續誘導培養大約3h。取誘導和未誘導的菌液各1.5mL，12，000rpm離心30s，收集到的菌體重懸于100uL 1XSDS加樣緩沖液，沸水浴5min，12，000rpm離心10min。

   4) 取上清進行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并用考馬斯亮藍染色。

3. OsCCTl抗原的大量誘導表達

   1) 轉接100uL已確定高表達的菌液至5mL含有Amp的LB液體培養基中，37℃ 220rpm培養過夜。

   2) 取1mL過夜培養的菌液轉接到1L新鮮的LB抗性培養基中，37℃ 220rpm培養至OD₆₀₀=0.5，加入1M IPTG至終濃度為1 mM，繼續誘導培養大約3h。

   3) 室溫下4，000rpm離心l 0min收集菌體以待純化。

所用的培養基和溶液配方如下:

4. 透析袋的處理

   1) 將透析袋(通透孔徑為10Kd剪成適當長度的小段后，在500mL含有2% Na₂CO₃和1 mM EDTA (pH 8.0)的溶液中煮沸10min。

   2) 蒸餾水充分洗滌后，將其在500mL 1mM EDTA(pH 8.0)的溶液中煮沸l 0min。冷卻后將透析袋連同上述溶液一起保存于4℃。

5. OsCCTlb抗原的大量純化

   1) 按10mL/1 g的比例用Buffer B重懸菌體，冰浴裂解lh。取2mL Ni-NTA resin裝柱，用20mL Buffer B預平衡Ni-NTA柱。

   2) 將裂解好的菌體于4℃ 10,000g離心30min，保留上清上柱。待上清全部過柱后，用100mL Buffer C洗去非特異性結合在柱子上的蛋白。

   3) 加入l0mL Buffer C重懸Ni-NTA resin，再加入2mL 6XSDS加樣緩沖液，混勻后沸水浴5min，室溫下4，000rpm離心5min。將上清(大約12mL)全部進行SDS-PAGE。

   4) 電泳完畢后，將凝膠浸泡在CuCl₂染色液中片刻直至沒有蛋白的部分變藍而有蛋白的部分沒有明顯變色。

   5) 切下含有蛋白的部分，將其在負染脫色液中脫色3次，每次20min，此時凝膠應該為透明。將凝膠切成小條，裝入50mL注射器中，擠壓使得凝膠變成碎片并從注射器口流出。

   6) 把破碎的凝膠裝入透析袋，在PBS緩沖液中4℃電泳過夜，電壓為30V。

   7) 電洗脫過夜后，收集透析袋中的液體，轉入一個新的透析袋中，于4℃條件下用PEG20,000濃縮至1mL左右。此時得到的變性OsCCTlb抗原大約為15mg。

所用的培養基和溶液:

7. OsCCTl抗原免疫

取l0mg變性OsCCTlb抗原免疫兔子。免疫后的抗血清分裝成1mL的小份后保存于-80℃。此抗血清可直接用于Western Blotting。