P81磷酸纖維素膜吸附實驗

P81 膜具有離子交換的特性，在較大 pH 范圍內帶有負電荷。在低 pH 條件下（如在本方案中用于洗膜的 75 mmol/L 正磷酸），激酶分析中過量的 [γ-³²P] ATP 并不與 P81 膜結合，而在此條件下帶正電荷的磷酸化多肽可結合在膜上。

堿性蛋白質比酸性蛋白質更適合吸附在 P81 膜上。組蛋白與膜的結合力較強，因為它是強堿性的，而酪蛋白的結合力很差，幾乎為零，因為它是較為酸性的蛋白質。

樣品

正磷酸 丙酮

P81 磷酸纖維素膜 500 ml塑料杯（其底被抗溶劑塑料或金屬網替換） 20 ml 閃爍瓶 閃爍計數器

1. 將膜裁成 2 cm × 2 cm 大小的小塊，在一端折疊，如圖 17.7.1，用鉛筆標記折線。將膜放置在一塊大的無吸收性的物質上，如塑料、丙烯酸膜或鋁箔包被的纖維板。

2. 從每個樣品管中吸取 15 μl 或 30 μl 樣品迅速滴在 P81 膜上。迅速將這些膜放置于帶抗溶劑塑料或金屬網底的 500 ml 塑料杯中（圖 17.7.2）。

3. 將此杯放入盛有 75 mmol/L 正磷酸和攪拌子的更大燒杯中，攪拌 5 min。

4. 將已使用的正磷酸洗液倒入可收集放射性廢料的容器中。重新將 75 mmol/L 正磷酸倒入大燒杯，攪拌 5 min 以上，重復以上清洗步驟，共洗 5 次。

5. 以丙酮充滿大燒杯，洗 P81 膜 5 min，棄丙酮，使膜干燥。

6. 將每個 P81 膜放入 20 ml 閃爍瓶中進行 Cerenkov 射線計數。

1. 通常為了確保信號能被檢出，將 50%～75% 的反應終產物滴在P81膜上。

2. 如果杯中的塑料網不能抗溶則會被丙酮洗液溶解。

3. 假如想獲得絕對 dpm 值且閃爍計數器可得 ³²P 的衰變曲線，可加入閃爍液計數。