退火溫度是影響PCR反應特異性的重要因素。
引物與模板復性所需要的退火溫度取決于引物的長度、堿基組成及其濃度。引物長度越短，引物中G+C的含量越低，所需的退火溫度越低。雖然降低退火溫度可能增加擴增產量，但引物與模板間的錯配現象也會增多，導致非特異性擴增上升。
相反，提高退火溫度雖然可以提高反應的特異性，但會引起擴增效率下降，甚至無擴增產物出現。引物的退火溫度可以通過Tm=4(G+C)+2(A+T)公式組略估算，一般在算出的Tm值上減去5攝氏度極為較合適反應設計退火溫度。
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