PCR在臨床檢驗中的應用（一）

醫學檢驗大致可分為形態學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發展。特別是1985年Mullis發明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現代醫學發展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經典的PCR反應在操作上稍有區別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優生優育、法醫學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環、泌尿生殖等不同系統相應的病變。消化系統感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發區，乙肝病人為世界乙肝病人總數的50％。乙肝病毒經血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發現提示其它傳染途經存在的可能。PCR法檢測乙肝的優勢表現在：

① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數量多少的最直接指標。在治療過程中通過監測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現及動態變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經口－口途經傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現為淺表性胃炎，可發展成為胃潰瘍。我國胃炎發病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發現可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。