PCR實驗操作常見問題及解決方法

1. cDNA產量的很低
可能的原因：
*RNA模板質量低
*對mRNA濃度估計過高
*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足
*同位素磷32過期
*反應體積過大，不應超過50μl

2. 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
*最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系
*與反應起始時RNA的總量及純度有關
*建議在試驗中加入對照RNA
*第一鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。
*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：
a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。
b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。

3. 產生非特異性條帶
*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。

4. 產生彌散（smear）條帶
*在PCR反應體系中第一鏈產物的含量過高
*減少引物的用量
*優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數
*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5. 產生大分子量的彌散條帶
*大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的
*對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果
*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。
*有可能是引物二聚體的條帶

7. 擴增產物滯留在加樣孔中
*有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。
*另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

8. SSⅢ與SSⅡ有何不同？
*具有更高的熱穩定性（達50℃）
*具有更長的半衰期（達220分鐘）
*對PCR無抑制
*干冰運輸
*Tdt活性更低
9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩定。

10. 為什么使用基因特異性引物（GSP）？
GSP在擴增低豐度的轉錄本時是好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

11. 什么情況下需要使用RNase H？
在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時

12. 根據不同的目的選擇不同的系統：
目的 建議
RT與PCR使用不同的引物
或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統
高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統
高特異性 含有適當的DNA聚合酶的兩步法RT-PCR系統
或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統
高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統
長的反轉錄結果 通常使用兩步法RT-PCR系統可達到結果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系統

二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）
*23-28個堿基長度，以提高引物特異性
*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低

2. 為什么得不到RACE產物？
*加入Hela對照
*低質量的RNA模板
*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成
*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環次數來解決，建議使用巢式PCR
*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太長而不適合進行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。
*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優化PCR反應參數及反應體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量區；使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應。

3. RACE的PCR結果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
*GSP與其他cDNA的非特異性結合會導致在擴增目的產物時得到無關產物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會導致產生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產物。
*RNA降解。
*PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因為沒有優化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。

4. 得不到全長的5’RACE PCR產物
*CIP反應后的RNA降解產生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。
*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。
*PCR產生了雜帶，并不是真正的連接產物，可以使用上述建議優化PCR。

二、Generacer
1. 如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？
使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：
*50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）
*23-28個堿基長度，以提高引物特異性
*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低

2. 為什么得不到RACE產物？
*加入Hela對照
*低質量的RNA模板
*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成
*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環次數來解決，建議使用巢式PCR
*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太長而不適合進行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。
*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優化PCR反應參數及反應體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量區；使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應。

3. RACE的PCR結果有雜帶
RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：
*GSP與其他cDNA的非特異性結合會導致在擴增目的產物時得到無關產物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會導致產生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產物。
*RNA降解。
*PCR管或試劑污染。
注意：雜帶一般是因為沒有優化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。

4. 得不到全長的5’RACE PCR產物
*CIP反應后的RNA降解產生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。
*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。
*PCR產生了雜帶，并不是真正的連接產物，可以使用上述建議優化PCR。

三、PCR
在進行PCR時：