PCR常用優化策略

PCR過程中如果沒有找到zui佳的擴增條件將會導致產生許多不確定的、不需要的產物，有時甚至沒有目的產物；而在另一個極端，又可能沒有擴增到任何產物。這時改變已知對引物－模板的忠實性和引物延伸有影響的諸多參數中的一兩個，將會達到優化擴增的目的。其中zui主要的優化變量包括 Mg2＋濃度、緩沖液pH值和循環條件，在循環條件中又以退火溫度zui為重要。 

1．降落PCR 
降落PCR代表了一種完全不同的PCR優化方法，它不是用許多反應管和每管用不同的試劑濃度和循環參數，而是用一個反應管或一小組反應管，在適合于擴增目的產物而不得到人為產物或引物二聚體的循環條件下反應；設計多循環反應的程序，使相連循環的退火溫度越來越低、由于開始時的退火溫度選擇高于估計的Tm值，隨著循環的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，并zui終低于這個水平。這個策略有利于確保*個引物－模板雜交事件發生在zui互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反應物之間。盡管退火溫度zui終會降到非特異雜交的Tm值，但此時目的擴增產物已開始幾何擴增，在剩下的循環中一直處于主導地位。由于目標是在較早的循環中避免低Tm值配對，在降落PCR中必需應用熱啟動技術。 
當引物和模板的同源性未知時，降落PCR尤其有價值，當引物是根據氨基酸序列設計的簡并引物時，或者擴增多基因家族成員時，或者想進行進化PCR時經常會碰到這種情況。編設降落PCR程序的目的是要設定一系列退火溫度越來越低的循環，退火溫度的范圍應該跨越15℃左右，從高于估計Tm值至少幾度到低于它10℃左右。目前大多數的PCR儀上都可以很方便地進行降落PCR。 

2．加入增強劑 
一系列輔助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非離子去污劑、甲胺酰（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作為增強劑加到反應中以提高特異性和產量。 

3．Mg2＋濃度調整 
Mg2＋濃度是一個zui容易控制的參數，因為所有的濃度變化都可以在不同的反應管中同時進行。Taq dna聚合酶的供應商現在除了提供標準緩沖液外還單獨提供MgCl2溶液，以簡化Mg2＋濃度的調節。一個典型的兩步優化過程可以首先包括Mg2＋濃度增幅為0.5mmol/L的從0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反應；當Mg2＋濃度范圍縮小以后再做第二輪優化，采用幾個增幅為0.2或0.3mmol/L的Mg2＋濃度。 

4．優化退火溫度； 
退火溫度的優化首先要采用幾種方法中的一種來計算引物－模板對的Tm值，其中zui簡單的方法是Tm＝4（G+C）+2（A+T），一個單一堿基的錯配大約降低Tm值5℃。也可以采用更加復雜的公式，但實踐中由于Tm值受緩沖液中各個成分甚至引物和模板濃度的不同影響，所以任何計算的Tm值都應該看作是大致值。進行退火溫度的摸索時有一定間隔（2～5℃），從高到低直到低于Tm值5℃的一系列反應可以大致估計出給定條件下的zui佳退火溫度。 

5．循環數和再擴增； 
增加循環數可以增強反應物的不足時的反應，但這樣會導致產生假帶以及富含單鏈DNA的高分子量成片產物。對于再擴增，總的原則是，如果*次PCR反應在凝膠上見到條帶，再擴增時只能用1μl*次PCR產物的1：104到1：105稀釋物。 

6．熱啟動PCR 
把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下，哪怕是作簡短的保溫，也可能產生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR方法則可以大大減少這些麻煩。其目標是在*個循環中等溫度升到超過反應物的Tm值以后才允許反應中的一或兩種關鍵成分進入反應。例如在覆蓋有礦物油的小實驗中，所有反應管中的一種公用成分（如Taq DNA聚合酶）可以先不加，而到*個循環的變性階段溫度超過80℃以后再加。