PCR技術操作程序與優化方法

作者：李愛麗等 來源：生物技術通報

典型的PCR操作

在此處僅列出—般PCR操作過程，具體影響因素的優化將在本章第二節討論，每一個具體操作前都需進行必要的優化。

（一） 試劑

（1）引物根據待擴增DNA不同，引物亦不同，引物的設計見本章第三節。

（2）耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫（93—100c），不同耐熱DNA聚合酶的特性詳見本章第4節。 Perkin—E1mer—cetus公司、N、F、Bio1ab、PharMacia公司、國內華美公司、復旦．大學和中國醫學科學院友誼公司等均有商品供應。

（3）10x PCR緩沖液： 500mm01／L KCl； 100mmol／L Tris一HCl（pH8.4， 20c），150mmol／L MgCl2， lmg／m1明膠。

（4）5mmo1／L dNTP貯備液：將dATP，dCTP，dGTPT和dTTP鈉鹽各100mg合并，加3m1滅菌去離子水溶解，用NaoH調pH至中性，分裝每份300v1， （-） 20℃保存cdNTP濃度最好用uv吸收法精確測定。另外。現在已有中性dNTP溶液商品供應（Sigma公司和Pharmacia公司等）。

（5）標本處理試劑：不同標本所需試劑不同，根據具體情況而定〔見本章第6節）。

（二） 操作程序

利用PcR擴增的操作程序基本相同，只是根據引物與靶序列的不同，選擇不同的反應體系與循環參數（見本章第：：節）o基本的操作是將PcR必需反應成分加入一微量離心管中，然后置于一定的循環參數條件下進行循環擴增。每個實驗室或每個人都有不同的操作習慣，但需遵守一定的操作規范。我們推薦下述操作程序，因這樣操作可最大程度地增加反應的成功率。

（1）向一微量離心管中依次加入：ddH2 O補至終體積（終體積50~100ul）10 x PCR緩沖液 1／10體積dNTP 各200umol／L引物 各1umol／LDNA模板 10*10一10*10*10*10*10拷貝混勻后，離心15s使反應成分集于管底。

（2）加石蠟油50—100ul于反應液表面以防蒸發。置反應管于97c變性7min（染色體DNA）或5min（質粒DNA）。

（3）冷至延伸溫度時，加入1—5U Taq DNA聚合酶，在此溫度作用1min。

（4）于變性溫度下使模板DNA變性適當時間。

（5）在復性溫度下使引物與模板雜交一定時間。

（6）在延伸溫度下使復性的引物延伸合適的時間。

（7）重復（4）一（6）步25—30次。每次即為一個PcR循環。

（8）微量瓊脂德凝膠電泳檢查擴增產物（見本章第7節）。

上述過程可以用PcR自動熱循環儀進行，也可以設定3個恒溫水浴鍋手工操作。