PCR技術

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在下依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR技術的特異性取決于引物和模板結合的特異性。反應分為變性、退火、延伸三步，經過一定的循環，介于兩個引物之間的特異DNA片段得到大量擴增。 

轉基因水稻葉片 DNA 引物

礦物油 MgCl2 Primer dNTP 水 溴酚藍 瓊脂糖凝膠 EB

離心機 電泳儀 紫外檢測儀

1.  調整模板濃度至10 ng/ml

2.  按下列體系配制反應混合液，混勻，加一滴礦物油，離心5秒
Template DNA        （20 ng）2 
buffer              2.0 ′10 μl
MgCl₂（25 mM）        1.5 μl
lmPrimer F (10 mM)        0.2 μl
Primer R (10 mM)        0.2 μl
lmdNTPs（2 mM）        2.0 μl
Taq（5 U/μl）  2.0 μl
Add ddH₂O  to    20 μl

3.  PCR反應循環條件設置：
95 ℃                     1 cycle
94 ℃   55 ℃  1'   72 ℃  1'30"   35 cycles
72 ℃                    1 cycle
4 ℃                       forever

溴酚藍，混勻，短暫離心，取15 ml
 
4.  檢測：加2 ml反應產物點樣電泳；

5.  在1%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳；EB染色，紫外觀察。

1. PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增，應注意防止反應體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這是造成假陽性最大的可能。

2. DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理，常規消耗用品用后作一次性處理，避免反復使用造成污染。

3. PCR在超凈臺內進行，操作前后紫外燈消毒。超凈臺內設內供PCR用微量離心機、一次性手套、整套移液器和其它必須品；移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。

4. PCR操作應戴手套并勤于更換。

5. 成套試劑，小量分裝，專一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。

6. 試劑管用前先瞬時離心（10s），使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機會。

7. 最后加模板DNA（包括在石蠟油后），馬上蓋好，混勻，瞬時離心（10s），使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。

8. 實驗設陽性、陰性對照。