在qPCR 技術中重要的參數指標有哪些？
擴增及溶解曲線：擴增曲線是PCR過程中，以循環數為橫坐標，以熒光強度為縱坐標所繪制的曲線。主要用于反映qPCR的動態進程；溶解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，溶解曲線就會出現單峰，如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個峰。
熒光域值（threshold）: 是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設置是PCR反應前3-15個循環熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。
Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環數。將已知濃度的標準品梯度稀釋進行qPCR，按照起始DNA量由多到少的順序等間隔得到一系列擴增曲線。Ct值與起始模板數的對數值之間存在線性關系，可以制作標準曲線。未知濃度的樣品也得到Ct值，代入標準曲線，就可以求出未知樣品的起始模板量。
擴增曲線一般分為哪幾個階段
熒光擴增曲線一般分為基線期、指數增長期和平臺期。在qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，此時即為基線期，
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數形式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數形式生成模板，從而進入平臺期，在該時期，擴增產物已不再呈指數級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，只有在熒光信號的指數增長期，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。
ROX染料是什么作用？
ROX（Passive Reference Dye）是一種惰性參比染料，在qPCR反應中能被qPCR儀檢測到。ROX不參與qPCR反應，熒光信號值不會隨著qPCR擴增而改變。實驗過程中很多因素會引起孔間差異：不均勻的照明，孔與孔之間光學因素（液滴、氣泡）的因素，反應體系的濃度不同…… 可以用ROX作為陽性參比，對其他熒光信號進行歸一化校正，以提高數據的精確度。
Ct值多少才算理想
一般來說Ct值在30以下都可以說實驗結果是可靠的，30以上基本可以說明該基因沒有擴增，但也不是絕對的，需要輔以溶解曲線加以解釋。
*** qPCR 常見問題分析 ***
| 問題類型 | 原因分析 |
| 無Ct值出現 | * 檢測熒光信號的步驟有誤：一般染料法采用72℃延伸時采集，探針法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號； * 引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性； * 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起； * 模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況 |
| Ct 值出現過晚（Ct>38） | * 擴增效率低：反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等； * PCR各種反應成分的降解或加樣量不足； * PCR產物太長：一般采用80-150bp的產物長度 |
| 標準曲線線性關系不佳 | * 加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度； * 標準品出現降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品 * 引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針； * 模板中存在抑制物，或模板濃度過高 |
| 擴增曲線異常，比如 S 型曲線 | * 參比染料設定不正確：預混液不加參比染料時，選NONE； * 模板的濃度太高或者降解； * 熒光染料的降解 |
| 負對照有信號、溶解曲線不止一個主峰 | * 引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現 * 引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比 * 鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒； |
| 擴增效率低 | * 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解； * 反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度； * 反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響 |