PCR突然擴增不出產物是什么原因

擴增不出產物那就根據PCR體系的組分和條件去思考分析。具體如下：

1）模板DNA：

是否被降解：DNA是不是溶解在1X TE（10 mM Tris-HCl，Hp8.0, 1 mM EDTA）里面的，因為核酸酶是金屬離子依賴的，保存在1X TE里面既能通過EDTA的螯合作用保護DNA不被降解，又為DNA提供了一個緩沖環境。

所以基因組DNA或者質粒通常都是溶解保存在1X TE里的，溶解在水里會相對比較容易降解，而且沒有緩沖環境的幫助，DNA長時間保存容易析出。

所以先跑個膠檢查一下是不是模板被降解了，還有DNA每次從-20拿出來用的時候，要稍微離心一下或者輕彈管壁充分溶解再用，避免你吸的時候只吸到水。就像可樂結冰了重新溶解一樣，會看到不均勻的現象。

DNA濃度：因為質粒擴增和基因組擴增用的模板量會有差別，質粒的DNA復雜度相對較低，而且單一，和基因組DNA相比，相同ng情況下有更高拷貝的目的基因，會更容易P出來。

而基因組DNA會比質粒要難P一點，不僅是因為序列復雜度還有拷貝數的問題，不同的人不同的提取方法，提出來的DNA質量參差不齊（會比質粒相對要更難提取一點，因為會結合很多組蛋白之類的其他物質），這也會影響擴增。

而PCR擴增對模板的量也是有一個比較合適范圍的，你可以分別用師兄師姐給的確定能P出來的質粒和基因組DNA，按照他們的經驗給的最適模板量，在最適模板量上下設置一個梯度范圍去擴增，找到自己認為的最適模板濃度。注意質粒和基因組要求的模板量不同，基因組通常要更多的模板DNA

DNA的質量：根據A260/A280，判斷一下你提的DNA質量，質量不好的就重新提一下吧，不要偷懶。

2）引物：

引物濃度：引物濃度盡量按照酶的說明書給的濃度，自己再那個濃度再設置一個范圍去摸索一下。

引物設計是否合理：這個你可以設計好之后，讓師兄師姐幫忙檢查一下，避免設計的引物有問題，導致后面實驗不斷重復還找不到原因。

3）DNA聚合酶：我們實驗室用的是KOD FX，這個酶很好用，擴增能力很強，保真性也挺高。酶要保存在-20，用的時候也要放在冰上，加完就盡快放回-20，這樣對酶的保護是比較好的，避免因為保存不當，一管酶用到后面活性下降了，導致擴增不出來。

4）dNTP，酶反應的buffer：這個沒什么好說的，根據說明書或者師兄師姐給的體系配就好了，通常不會出錯，除非你忘記加了。

PCR體系的組分就以上那幾樣，剩下的就是用水補齊了，也沒什么好說的。接下來是反應條件。