【實驗目的】
1．了解PCR-DHPLC技術的原理。
2．了解并熟悉PCR-DHPLC技術的步驟。
【實驗原理】
DHPLC技術也稱為WAVE核苷酸片段分析系統。利用高效液相色譜原理，PCR擴增后的DNA片段與緩沖液（TEAA）混合形成液相，流動相被高壓驅動，通過一個DNA分離柱——DNA Sep柱，該柱可對DNA片段進行分離和分析。變性溫度是影響DNA片段分析的一個重要因素，變性溫度升高，保留時間縮短。洗脫的核苷酸片段經檢測器檢測后轉換為數字信號記錄并儲存于計算機中。
在部分變性條件下，DNA Sep柱可檢測突變。雜合的個體在部分變性條件下（95℃變性后逐漸冷卻到一定溫度）形成純合和雜合雙鏈。兩者通過DNA Sep柱時保留時間不同而得以區分。
DHPLC方法不需要灌膠、上樣、電泳等繁瑣的操作，快速、自動，可檢測片段長達1500bp，準確率達 96%以上。
【實驗用品】
1．PCR擴增儀；WAVE DNA片段分析系統；凝膠成像及分析系統；紫外透射儀；高速離心機；電泳儀；電泳槽。
2．TEAA、乙腈、瓊脂糖
3．微量加樣器（200μl，20μl）；Tip頭（200μl，20μl）。Tip頭盒（200μl，20μl）；Eppendorf管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf管架。
4．PCR擴增相關試劑。
【實驗步驟】
1．PCR反應（同前）
2．PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。
3．緩慢變性
95℃變性5分鐘，然后以 0.03℃/S速率緩慢復性至25℃，使雜合子形成異源雙鏈。
4．確定熔解溫度
根據溫度預測軟件對DNA片段進行序列分析，確定熔解溫度。
5．取10μl緩慢變性PCR產物上樣，分析流出峰峰形。
【實驗結果分析】
觀察并記錄流出峰峰形及位置，根據異常峰形篩查突變樣本。