注意事項
1.培養基成分對轉化率影響較大,注意其有效期。
2.小牛血清用前需滅活。
3.培養時要保證有足夠的氣體,一般10ml培養瓶內液體總量不要超過2ml。
4.PHA劑量過大對細胞有毒性,太小不足以刺激淋巴細胞轉化,試驗前應先測定PHA轉化反應劑量。
5.實驗中要嚴格無菌操作,防止污染。
不合宜人群: 暫時不明
檢查前禁忌:注意健康的飲食,保持良好的心情
檢查時要求:積極配合醫生
檢查過程
操作方法:
1.取無菌肝素抗凝血0.lml,加入1.8ml細胞培養液中,同時加入1 000μg/m1 PHA 0.1m1,對照管不加PHA,將細胞置37℃、5%CO2培養3d,每天搖動1次。
2.培養結束時吸棄大部分上清液,加入8.5g/L NH4Cl 4ml混勻,置37℃水浴10min。
3.2500r/min離心10min,棄上清液,沉淀加5ml固定液,室溫作用5min。
4.2500r/min離心10min,棄上清液,留0.2ml沉淀細胞制片,迅速吹干。
5.吉姆薩染液染色 10-20min,水洗,干燥。
6.油鏡計數200個淋巴細胞中轉化的細胞數,計算轉化率。
結果判斷:
1.淋巴母細胞的形態學標準 細胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性及核的構造與核仁的有無。
⑴成熟的小淋巴細胞:與未經培養的小淋巴細胞大小一樣,為6-8μm,核染色致密,無核仁,核與胞漿比例大,胞漿染色為輕度嗜堿性。
⑵過渡型淋巴細胞:比小淋巴細胞大,約10-20μm,核染色致密,但出現核仁,此為與成熟小淋巴細胞鑒別要點。
⑶淋巴母細胞:細胞體積增大,約20-30μm,形態不整齊,常有小突出,核變大,核質染色疏松,有核仁1-2個,胞漿變寬,常出現胞漿空泡。
⑷其它細胞:如中性粒細胞在培養72h后,絕大部分衰變或死亡呈碎片。
2.淋巴細胞轉化率的計算 按上述分類檢查推片頭、體、尾三部分,計數200個淋巴細胞,算出百分率。轉化的淋巴細胞包括淋巴母細胞和過渡型淋巴細胞,未轉化的淋巴細胞指的是成熟的小淋巴細胞。在正常情況下,PHA誘導的淋巴細胞轉化率為60-80%,如為50-60%則偏低,50%以下則為降低。
再根據結果得出正確的判斷。