基本方案
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | PK-120 |
| 試劑、試劑盒 | Q-Sepharose 樹脂 S-Sepharose 樹脂 Hudroxyapatite 羥基磷灰石 Sephacryl S－200 凝膠 賴氨酸內切酶 乙腈 三氯醋酸 |
| 儀器、耗材 | Applied Biosystems model 477A 氣相蛋白質測定儀 Applied Biosystems model 120A PTH 分析儀 反相高壓也像系統 uBondasphere S-5 C8 300A 柱（2.1 mm×150 mm） TSK-GEL ODS-120T 柱（4.6 mm×150 mm） |
| 實驗步驟 |
1. PK－120 的純化 1.1 聚乙二醇組分制備 枸櫞酸磷酸右旋糖杭凝人血漿 500 ml， 使其含有 1 mol/L PMSF（蛋白酶抑制劑），0.1 mg/ml polybrene，100 mmol/L 賴氨酸，8 mmol/L BaCl2， 然后加入 25 g 聚乙二醇 4000（PEG），攪拌 30 min ，6000 r/min 離心 10 min，離心沉淀溶于 200 ml 含 1 mmol/PMSF，0.01 mg/ml SBTl（大豆來源的胰蛋酶抑制劑），2 ug/ml FUT－175，10 mmol/L 賴氨酸，20 mmol/L Tris－HCl 緩沖液（pH 7.4）， 以 15％ PEG 再沉淀。6000 r/min 離心 10 min，以相同緩沖液 300 ml 溶解沉淀，置 4℃ 備用。以下柱層析操作中的緩沖液都含有上述蛋白酶抑制劑。 1.2 Q-Sepharose 柱層析 柱體積為 4 cm×27 cm，預先用含 10 mmol/L 賴氨酸 20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）平衡，將上述制備的血漿 PEG 組分上樣，流速為 190 ml/h。先用 500 ml 平衡緩沖液洗脫，洗去未吸附的雜蛋白，然后用含 0.05～0.2mol/L NaCl 的緩沖液（總體積為 1000 ml），線性洗脫，收集的各組分和 PK（血漿激肽釋放酶）在 37℃ 下，溫孵 30 min，進行 SDS-PAGE 電泳及考馬斯亮藍染色，被 PK 水解的 120 kDa 蛋白為 PK-120，制備抗體后，用雙向免疫擴散法或免疫印跡法進行檢測，從而鑒定含有 PK-120 的蛋白組分 1.3 S-Sepharose 柱層析 將上述得到的 PK－120 組分中加入 PEG， 終濃度達 20％， 用 1 mol/L HCl 調 pH 至 7.0， 離心回收沉淀，用含 10 mmol/L EACA（氨基己酸、50 mmol/L 醋酸鈉緩沖液（pH6.0）溶解沉淀，預先用相同緩沖液平衡 S-Sepharose 柱（2.5 cm × 13.5 cm），上樣。充分冼脫，除去雜蛋白，用含 0.025～0.03mol/L NaCl 的緩沖液線性洗脫，流速 170 ml/h，PK－120 的鑒定方法同上。 1.4 HTP（羥基磷灰石）柱層析 用 10 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）平衡 HTP 柱（1.8 cm × 10 cm）。PK-120 組分上樣，用 20 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.4）洗脫，流速 120 ml/h。 1.5 Sepharyl S-200 凝膠過濾柱層析 上一步驟得到的 PK-120 組分，用 Centriflo membrane（25kDa cutoff；Amicon）濃縮，以含 0.1mol/L NaCl，0.1％NaN3，50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4）平衡 Sepharyl S-200 柱（2.4 cm × 63 cm）。上樣，洗脫，流速 20 ml/h。由此得到的 PK-120 作為純化樣品供以下實驗用。 2. 分離純化肽段及測定氨基酸序列 純化的
PK-120 溫孵，37℃ 30 min（酶與底物的比例為 1:50）。用 0.1 mol/L NaCl，Tris-HCl 緩沖液（pH
7.4）平衡 Sepharyl S-200 柱（2.4 cm × 63 cm）。上樣。由 PK 水解 PK-120 產生的 70kDa 和
35kDa 分別來自 PK-120 的 N 末端和 35kDa 片段經賴氨酸內切酶水解測定的多肽序列 C 末端。由 C 末端來源的 35kDa
經吡啶乙基化（S-pyridyethylation）還原反應，再用賴氨酸內切酶水解，37℃，16 h（酶與底物的比例
1:50）。上樣反相高壓液相 BondasphereS-5C8 300A
柱，流動相為水-乙腈-0.1％TFA，收集各組分，進一步上樣方向高壓液相 TSK-GEL ODS-120T 柱進行層析分離，收集洗脫各肽段，用
Applied Biosystems model 477A 氣相蛋白質自動測序儀/Applied Biosystems 120 APTH
分析儀以 Edman 降解法對分離肽段 N 末端進行氨基酸序列分析，結果如圖所示。
展開 |
