基本方案
| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | cDNA |
| 試劑、試劑盒 | Ready-To-Go DNA 標記試劑盒 人肝臟 λgt11 cDNA 文庫 人肝臟 λgt10 cDNA 文庫 雜交溶液 SSC 溶液 pBluescript II SK 載體 |
| 儀器、耗材 | PCR 擴增儀 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「試劑」具體見「其他」 1. 雜交反應 抽提出的 50bp 的 PCR 產物用 PCR II 載體亞克隆，大量制備，用限制性消化酶 EcoRI 將 50bp 的插入片段切下，用 [α-32P] dCTP 標記已克隆的 50bp DNA，并作為探針篩選人肝臟 λgt11 cDNA 文庫，獲得 11 個陽性克隆，測定最長的陽性克隆 λPK5 序列，這個克隆（1.7kb）編碼的 PK-120 的碳末端，為了獲得編碼 PK-120 其余部分的克隆，用 [32P dCTP] 標記的 λPK5 插入片段作為探針篩選人肝臟 λgt10 cDNA 文庫，在雜交液中 60℃ 預雜交， 65℃ 雜交過夜，然后在 60℃ 用 0.1％SDS 的 2×SSC 溶液 30 min 洗 4 次，洗凈。將陽性克隆的插入片段進一步亞克隆，插入 Bluescript II SK-vector 載體，獲得 106 個陽性克隆，測定陽性克隆 λPK67（3.0kb）序列，λPK67 編碼 PK-120 的非 5' 端密碼子區域及 PK-120 氮末端，并含有信號肽序列。 2. cDNA 推測 PK-120 一級結構的特征 PK-120 的核苷酸序列據此推導的氨基酸序列見圖。 PK-120 的 cDNA。編碼區為開放閱讀框，有 2790bp，以密碼 ATG 為起始，以密碼 TAG 為結尾，從而推測出 PK-120 蛋白質氨基酸序列。它含有 28 個氨基酸組成的信號肽，成熟蛋白有 902 個氨基酸組成， 20％ 序列為蛋白質測序所證明。有四個 N-糖基化部位，有三個半胱氨酸殘疾，這和 PK-120 的氨基酸組成測定結果一致。 Cys719 和 Cys892 在 35kDa 片段內形成二硫鍵，Cys186 以游離狀態存在。PK 的酶切位點附近的序列是 -Phe-Arg-Xaa-Arg455，Arg633 和 Arg660 是 PK 的切斷部分。 據同源性分析表明：PK-120 氨基酸序列和人胰蛋白酶抑制劑 （inter-α-trypsin inhibitor，ITI）超家族的重鏈 HCs 有關，和 HC1，HC2 分別具有 34％，31％ 的同源性，和人前 α 胰蛋白酶抑制劑 HC3 有 38％ 的同源性。已有的研究表明，PK-120 和 ITI 一樣，是一種主要急性相蛋白，這為研究炎癥產生的復雜過程打開了新的大門。
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| 注意事項 | |
| 其他 |
試劑： Ready－To－Go DNA 標記試劑盒 人肝臟 λgt11 cDNA 文庫 人肝臟 λgt10 cDNA 文庫 雜交溶液：7％（w/v）聚乙二醇 6000，10％ SDS，100ug/ml 酵母 tRNA SSC 溶液：15 mmol/L 枸櫞酸鈉，15 mmol/L NaCl，pH 7.0 pBluescript II SK 載體 |