一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在后面的數據分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到一個最佳反應體系。在反應體系配置過程中，有下面幾點需要注意：
1. MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！
4. 所有成分加完后，離心去除氣泡。
5. 每個樣品至少3個平行孔。
參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的注冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。
通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由于其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束后，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。
3. 儀器設置
所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：
A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為“BioTeke”，進行“定量”實驗。
B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。
C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。
E. 對照組和內參基因的設置：這個是為后面的定量做準備
F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鐘）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。
G. 反應體系的設置：
A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。
需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面；也有的是單獨分開。要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇“none”。
設置好之后，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！
Real-time qPCR數據分析
1. Real-time qPCR常見參數
基線（baseline）
通常是3-15個循環的熒光信號
同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線
閾值（threshold）
自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍
手動設置：置于指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。
同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。
Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。
分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。
Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果（△Rn=Rn-基線）。
2.影響Ct值的關鍵因素
模板濃度
模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。
反應液成分的影響
任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。
PCR反應的效率
PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。
3. 如何評估實時定量PCR反應的效果
PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。
常見問題
1. 無Ct值出現
檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。
引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。
模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。
模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
2. Ct值出現過晚（Ct>38）
擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。
PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。
PCR產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。
3. 標準曲線線性關系不佳
加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。
標準品出現降解: 應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品。
引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。
模板中存在抑制物，或模板濃度過高
4. 負對照有信號
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
5. 溶解曲線不止一個主峰
引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。
引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。
鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。
模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。
6. 擴增效率低
反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。
反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。
反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？
判斷標準：擴增效率，靈敏度，特異性
如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用于分析。
8. 擴增曲線的異常？比如“S”型曲線？
參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)
模板的濃度太高或者降解
熒光染料的降解
熒光定量PCR問題匯總
1. 定量PCR儀的開關機順序是怎樣的？
按照正確的開關機順序操作，有助于延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。
開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。
關機順序：確認實驗已經結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR儀主機的電源，最后關閉電腦。
2. 哪些種類的反應管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？
定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學反應板配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合平蓋的光學八聯管蓋。ABI公司生產的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：
3. 為什么要定期對電腦進行磁盤碎片整理？怎樣整理？
當運行實時定量PCR儀及使用軟件分析實驗結果時，計算機會刪除并創建若干文件，計算機硬盤的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當硬盤驅動器上文件以分解的碎片存儲時，程序需要更長的時間才能存取文件，因為必須多次尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程序將一個文件分解開的多個碎片合并在一起，并存儲到硬盤的同一個位置，從而清除文件碎片，進而優化系統性能。
碎片整理的方法如下：
· 在Windows桌面上，選擇開始(start)，我的電腦(My computer)。
· 在(我的電腦)窗口中，用鼠標右鍵單擊硬盤驅動器，并選擇(屬性)property。
· 在(屬性)對話框中選擇工具(Tools)選項卡，單擊開始整理(Defragment now)。
· 單擊碎片整理(Defragment)。
· 當顯示“碎片整理完畢”對話框時，單擊（確定）。
· 在“本地磁盤屬性”對話框中，單擊（確定）。
· 為計算機機中剩余的驅動器重復如上步驟。
4. 何時執行windows service pack更新？
不要執行該操作。除非美國應用生物系統公司代表通知您更新操作系統，否則請不要更新控制定量PCR 儀的計算機的操作系統。新版本的Microsoft Windows操作系統有可能與SDS 軟件存在沖突，并導致儀器不能正常運行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新操作系統，應查看隨SDS 軟件提供的版本說明，避免兼容性問題。