Qtrap5500：生物標志物確證分析的最佳技術平臺

　　2010年5月15日~17日，在云南麗江召開的蛋白質組數據處理暨第三屆全國生物質譜學術交流會上， AB SCIEX公司于15日中午舉辦了新技術推廣&午餐招待會。來自AB SCIEX公司質譜市場產品經理劉麟先生，向大家介紹了AB公司Qtrap 5500在蛋白質組學定量分析中的新技術及其新應用。

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AB SCIEX公司新技術推廣和午餐招待會現場

AB SCIEX公司質譜市場產品經理 劉麟先生

　　高效實現強大的MRM³定量方法

　　AB Sciex公司推出的Qtrap 5500系統具備更高的靈敏度、更好的阱內裂解效率、更快的掃描速度以及更快的MRM³掃描方式。在分析生物樣品時，樣品一般都較為復雜，所以在某些特殊的情況下，分析人員需要選擇性更高的檢測技術，MRM³技術便能夠幫助分析人員解決上述問題。

　　所謂MRM³掃描方式就是通過Qtrap 5500質譜系統與液相色譜相配合，在Q1選擇一個前體離子，在Q2中將該離子進行碎裂，與MRM掃描方式不同在于MRM³掃描方式是將所有的碎片離子聚集在線性加速離子阱中，之后，在離子阱中以高達10K或20KDa/Sec的速度掃描特定的二代碎片離子，從而獲得MRM³譜圖。

　　那么，什么時候需要使用MRM³掃描方式呢?劉經理給出的答案是：(1)MRM掃描背景噪音較高，或譜圖中有干擾峰存在；(2)通過更換流動相、優化液相色譜條件、選擇不同的MRM離子對、選擇不同的離子化方式等這些簡單方法無法消除背景噪音；(3)與背景噪音相比，沒有特定的MRM子離子可用，在遇到上述這些干擾和困難時，MRM³就是一種有效的定量策略。

　　接下來，劉經理具體例舉了通過MRM³掃描方式定量檢測血漿中多肽藥物Exenatide和血漿中前列腺特異性抗原(PSA)這兩個例子。Exenatide在臨床上用于治療II型糖尿病，分子量為4186.6Da。通過選擇MRM和MRM³這兩種定量掃描方式進行比較，得出血漿樣品中的背景干擾影響了MRM的選擇性，定量下限(LOQ)大概是100ng/mL，而采用MRM³掃描方式完全消除了干擾物，LOQ提高了20倍以上。

　　前列腺特異性抗原(PSA)是臨床診斷前列腺癌的主要指標，在臨床上通常采用ELISA的方法進行檢測，該實驗分別對四組樣品進行MRM³和ELISA方法進行比對分析，得出兩種技術檢測結果相近。

 

　　脂質分析

　　脂類物質是細胞膜的重要組成成分，在細胞功能上扮演著重要的角色，所有的脂類都有一個極性頭部和熟睡的尾巴，或至少是代謝后生成此類分子。作為細胞能量儲存，并且參與細胞間的信息交換。了解脂類代謝途徑有益于設計高效且副作用小的藥物，對于生物體生理過程和藥物設計有著重要的意義。譬如阿司匹林、布洛芬與脂類代謝相關，降低膽固醇的他汀藥物，也能戲劇性的改變脂類代謝。

　　傳統研究脂類物質的技術方法包括有：薄層層析、氣相色譜以及氣質聯用技術。氣質聯用技術通常分析經分離純化的脂類衍生物，但衍生化方法通常易導致脂類發生變化，破壞了脂類分子的完整性。

　　液質聯用技術可以解決上述問題，幫助分析人員鑒定脂類、了解脂類類別、獲得脂類的表達譜、比較脂類表達譜、獲得結構信息、測定分子量以及代謝物定量。LC/MS/MS不同于GC/MS，它可使研究人員能夠觀察到完整的脂類分子，直觀地看到何種脂肪酸連接在頭部基團上。

　　劉經理指出目前運用液質聯用技術進行脂質分析仍處在不斷地發展過程中，該分析平臺也可分為已發現標志物(Targeted)和尋找標志物(Non-Targeted)這兩大類，前者主要檢測已知樣品的質量數，通過統計學分析確定這些分子在大量樣品中的變化，從而進行定量分析；后者則要找到樣品中存在的差異，鑒定哪些質量數在樣品中存在差異，主要進行定性分析。

　　了解脂質的多樣性包括有(1)每一類別中酰基或烷基鏈長度和不飽和度的不同；(2)脂質提取物的質譜數據中包含許多質量數相同但結構不同的分子；(3)選擇不同的溶劑，將嚴重影響不同類別脂質分子的離子化效率和離子抑制。劉經理在這里指出如通過targeted methods(目標性方法)進行脂質分析，譬如前提離子掃描和中性丟失的掃描方式，既可降低復雜性，又可同時平行掃描數百種脂類分子。

 

　　多重全體離子掃描方式(MPIS)

　　多重全體離子掃描方式(Multiplexed Precursor Ion Scanning， MPIS)便可實現上述的檢測分析，多重全體離子掃描方式具體指指固定在Q3掃描某個碎片離子，通過分析檢測出哪個前體離子會產生出該碎片離子，并將該離子的信號記錄下來。通過這樣反復不斷地掃描，便可以推導出哪些前提離子將會產生某一個碎片離子。該方法的技術優勢在可對所有感興趣的脂類分子和內標分子進行平行檢測，圖譜了直觀解析并可以疊加用于復雜脂類的定性分析，可方便的從前提離子掃描切換到MRM掃描，用于脂類分子的定量分析。

　　劉經理例舉了通過多重全體離子掃描方式檢測非酒精性脂肪肝病人肝臟組織中磷脂和脂肪酸的表達譜。之所以對上述兩種脂類分子進行檢測，是由于磷脂酰膽堿(PC)與磷脂酰乙醇胺(PE)的比值可用于監測肝細胞膜的完整性，脂肪酸的表達譜能夠深入了解肝酶活性和脂肪代謝。該實驗技通過直接進樣的方式檢測肝細胞和血細胞脂類提取物中磷脂和脂肪酸的表達譜。

　　實驗流程采用Qtrap 5500系統，利用其正離子和負離子掃描可以在一次實驗中進行和每個循環周期60次前體離子掃描或中性丟失掃描的優勢。在樣品進樣方面，劉經理著重介紹了Advion NanoMate直接進樣納噴霧系統，該系統裝有96孔板，在每個孔上配有Nano離線噴針，每一個離線噴針里裝有脂類物質，所以能夠不斷連續的、離線的進行噴霧，無需再接液相。

　　在數據分析方面，該實驗用到了LipidView^TM軟件，劉經理介紹到該軟件功能十分強大，不但可以進行數據庫檢索，同時也可對脂類分子進行定量分析。該數據庫中現有44類，約23000種脂質分子，大于600個脂類特征碎片離子信息，該軟件支持AB Sciex所有型號的LC/MS/MS。

　　通過分析得出結論：(1)患有非酒精性脂肪肝病人的長鏈脂肪酸(大于20個C)的表達量遠遠高于正常人；(2)在負離子掃描模式下，病人與正常人的磷脂酰膽堿表達量沒有太大的差別，但在正離子掃描模式下，病人與正常人相比長鏈磷脂酰膽堿的表達量顯著減少；(3)非酒精性脂肪肝病人樣本中，與正常人對照組相比較，磷脂酰乙醇胺保持相對穩定。

　　通過對PC和PE數據進行比較發現，在肝細胞中病人的PC/PE比值明顯低于正常人。單從PC數據來看，無論是在正離子還是負離子的掃描模式下，病人的PC表達量要遠遠低于正常人，又由于正常人和病人的PE表達量基本一致，所以得出結論：PC表達量的較少，導致病人的PC/PE值低于正常人群。在血細胞中病人與正常人的PC/PE比值基本一致，說明非酒精性脂肪肝病癥主要是由于肝細胞膜發生變化所導致的。

　　在劉經理精彩的報告后，AB Sciex公司還特設有抽獎環節，并為獲獎嘉賓精心準備了一份小禮物。

浙江工商大學張虹教授 上臺抽出幸運嘉賓