摘 要： RACE是一種快速克隆cDNA末端的方法，目前, 該方法被廣泛應用于未知堿基序列基因的克隆，尤其是SMART RACE技術更為人們所青睞。本文總結了我們實驗室用SMART RACE技術克隆基因的一些心得體會，希望對用RACE方法克隆基因的同行有些幫助。
關鍵詞： RACE; RNA提取; 兼并引物
中圖分類號 :Ｑ75 文獻標識碼 :Ａ
Some Suggestions on Gene Cloning by RACE-PCR
Abstacts：RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) is a method of quickly cloning of cDNA ends, thus, this method was widely noticed by scholars of biology, from now on, its was abroad used in animal and plant gene cloning. However it should be pay attention to following three aspects: firstly, primers design is should be think over; secondly, it is very important of the quantity of RNA; thirdly, the optimization of PCR conditions you should be give more attention to. In this paper, we discussed three important questions in RACE-PCR, we hopes this paper will help those who is going to engaged in cloning new genes by RACE-PCR.
Keyword: RACE; RNA extraction; Degenerate primer
真核細胞的mRNA在加工過程中其3'末端加上一段Poly A，這是利用反轉錄酶制備cDNA文庫的基礎，但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，曾經是一個令人困擾的問題。80年代末、90年代初發展起來的一種快速獲取cDNA全長的方法，即RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)，目前這個方法被廣泛用于克隆各種未報道的基因，該方法基于PCR技術，步驟少，耗時短，且經濟節省，只需知道mRNA內部很短的一段序列或一小段cDNA（如EST）即可用此法克隆出未知的序列。目前，RACE已經不局限在克隆cDNA上，在克隆cDNA相鄰序列以及基因組片段等方面也得到越來越廣泛的應用。RACE技術使傳統篩庫的方法尋找全長基因的過程從幾個月，縮短為幾天。尤其對于低豐度基因的克隆優勢更為顯著[1]。
我們實驗室用在合成cDNA的雙鏈后，在兩端連上接頭引物，利用已知的接頭序列再進行擴增，或者是利用末端轉移酶在雙鏈cDNA的3'末端加上一連串的G或者C（或者A/T），再通過補齊粘末端，利用已知的兩頭序列進行擴增,分別從水稻和小麥中克隆到了TPT[2,3]。但是這些方法不同程度的存在一些問題，比如接頭的連接效率非常有限，會導致部分信息的丟失，再加上這些方法需要多次用不同的酶處理有限的樣品，需要經過反復的純化，會損失很多有用的信息，特別是少量樣品中的低豐度信息，很大程度上會影響結果的準確性。此外，由于mRNA容易降解，很難確定得到的cDNA是全長的cDNA，還是cDNA的片斷？
RNA反轉錄5’末端交換機制（Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript，SMART）技術的出現是一個新的里程碑。其原理如下：在合成cDNA的反應中，事先加入的5'末端帶Oligo（dT）的SMART引物（如5'–(T)25N-1N–3'，N = A, C, G或T；N-1 = A, G或 C），由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5'末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構”，即甲基化的G時會連續在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo dG（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3'）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列（5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG–3'），合成第二鏈后可以利用通用引物（UPM（Universal Primer Mix， Long：0.2mM， 5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'，Short：1mM，5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'）與NUP(Nested Universal Primer，10 mM， 5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'）進行擴增。由于有5'帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。這個方法是利用逆轉錄酶內源的末端轉移酶活性，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的總RNA就可以得到高質量、高產量的cDNA，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應用于直接擴增基因、構建cDNA文庫、利用部分已知序列克隆全長cDNA，和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等[4]。但對多數實驗室來說，用于做RACE的試劑盒太昂貴，對于一些經費充足的實驗室，雖然有RACE試劑盒，但總會碰到一些的問題，以下就做RACE的核心問題發表一些見解，供大家參考。
1用于RACE引物設計的原則
引物設計的優劣對于做RACE是至關重要的，如果引物的特異性不好，就會給實驗帶來許多麻煩，甚至擴增不到我們這實驗預期想的目的產物。以下是結合一些網上的資料和我們在多次實驗中總結出的引物設計的原則。
1.1 兼并引物的設計 用兼并引物擴增，一般是我們想克隆的物種中沒有我們想要克隆的目的基因的信息，但在其它物種中是存在的，我們就可以將其它物種該基因的序列進行序列同源性比較，同源性高的區域就是兼并引物設計的侯選區；或是假如這些基因的核酸序列的同源性不高，沒有合適的選擇區域，則我們可以用將其它物種該基因的序列翻譯成氨基酸序列，然后進行序列同源性比較，同源性高的區域一般是保守區，再用保守區氨基酸對應的核酸序列設計兼并引物，但兼并引物兼并度（即單條引物上各兼并堿基之和的乘積）應小于1000 ，且兼并引物的3’端應盡量減少兼并性，并使3’端最后6個堿基的G或C的含量大于50%，以提高特異性；此外，假如我們只知道氨基酸序列，則可根據不同物種密碼子的偏好性來設計引物。
1.2 有部分堿基序列的引物設計 對于用差異顯示(Differential Display Reverse Transcription ,DDRT)或者抑制減法雜交（Suppressive Subtractive Hybridization ，SSH）、RNA指紋、EST芯片及兼并引物擴增等方法得到DN□斷，要克隆全長cDNA，或者用同源序列克隆其他物種中的同源基因，3'端的擴增一般都不成問題，難就難在5'端的片斷擴增。利用SMART技術將SMART引物自動加入cDNA的5'端，不但能避免加接頭或者加一串堿基的麻煩，而且能得到全長的cDNA 5'端。只要少至25個堿基的已知序列即可克隆出全長的cDNA[4]。
如你欲克隆的基因在GenBank已列出的26種生物中，且是多基因家族的一個成員，則應先上網進行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，為了提高擴增的特異性，應選擇沒有同源性的區域設計引物。基因特異性引物（gene special primer，GSP）和套式引物 (nested primer，NP)的長度以23~28個堿基為宜，GC含量50%以上，且GSP的5’端6個堿基與UPM兩條引物的3’端互補堿基應＜4，NP的5’端6個堿基與NUP的3’端的互補堿基應＜4，如果不這樣的話，會影響擴增效率，這是因為PCR擴增的關鍵在3’端的特異性。
但如果是多基因家族的，且已知的信息有限，用RACE的產物可能出現多條帶，這不要緊，先將電泳后的膠上的條帶轉到尼龍膜上，可在EST序列中克隆一DN□段，用32P-dCTP標記，Southern印跡法，即可鑒定出來。
需要聲明的一點是，做RACE的引物與擴增已知序列的引物設計有所不同，5’RACE的GSP和NP引物為cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物為與cDNA反向互補的序列。用軟件或經驗公式提供的退火溫度只是一個參考值，在具體操作中要靈活多變。
2 RNA提取
RNA質量的好壞直接關系到實驗的成敗，雖然，植物組織RNA提取已有較好的文章發表[5]，我們實驗室在植物材料(蠶豆（Vicia faba L.）、擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)、水稻(Oryza sativa L.)、小麥(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.))中總結出了一種既便宜且優質高效的RNA提取方法，當然，Introvergene公司的TRIZOLTM Reagent有其快速高效的特點，但就我們提取RNA所用的植物，發現此方法提取的RNA比Introvergene公司的TRIZOLTM Reagent提取的RNA的質量要好。
2. 1 RNA提取前器具的準備和藥品的配制
實驗中用到的槍頭和EP管（Ependorff Tube）用蒸汽高壓滅菌121℃, 15lb，30min即可；研缽、藥匙和杵洗凈后用蒸餾水清洗2－3遍，涼干即可。
實驗中用到的藥品，4MGT(終濃度為4M硫氫酸胍（Guanidine thiocyanate），25mM檸檬酸鈉（Sodium citrate），0.5%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)，滅菌后加上終濃度為0.1M的β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）)；酸酚（水飽和酚＋抗氧化劑0.1%(w/v)δ-羥基喹啉δ-Hydroxyquinoline）；4M的氯化鋰（LiCl）；2M的乙酸鈉（NaAc）pH 4.9~5.2；3M的乙酸鈉（NaAc），配制以上藥品均用以DEPC(v/v 0.1%)處理的ddH2O（37℃處理12h以上）經滅菌后的無RNA酶的ddH2O配制。
2.2 RNA提取實驗操作步驟
研缽涼干后，倒入1/3體積液氮，加入0.2克均質的植物材料，充分研磨后轉入一個含有300μl 4M GT的1.5ml的EP管中，搖勻。加入30μl 2M NaAc（pH 4.9~5.2）搖勻，加入300μl酸酚(水飽和酚pH<5.0)，搖勻，加入100μl三氯甲烷（氯仿）搖勻。12500rpm 4℃ 離心20min，吸取上清的3/4，加入等體積異丙醇，于冰上放置15min。12500rpm 4℃ 離心10min，將沉淀懸浮于含100μl 4M LiCl 的1.5ml EP管中，于-20℃放置過夜。13000rpm 4℃ 離心10~15min，將沉淀溶于0.4ml DEPC處理水中，加入1/2體積氯仿和1/2體積酸酚，搖勻，進行抽提，13000rpm，4℃ 離心5min；上清加入等體積氯仿，搖勻，進行抽提，13000rpm 4℃ 離心5min。上清液加入1/10體積3M NaAc和2倍體積的無水乙醇于-20℃放置1h或更長時間。13000rpm 4℃ 離心15min，沉淀溶于20μl DEPC處理水中。RNA貯于-80℃或直接用于反轉錄。這種方法可能有DNA污染，但只要解鏈溫度時間較短（≤10s），則對做RACE影響不大。這個方法提取的不同植物的RNA見圖1。
3反轉錄與PCR條件的優化
對于用RACE方法克隆新基因的第三個問題就是PCR條件的優化，當然在這個過程中，有特異的引物，高質量的RNA是首要的，但由于反轉錄沒有做好，不適宜的PCR條件，那用RACE克隆基因也將功虧于簣。因此，這一步要特別小心，以下的方法主要來自CLONTECH試劑盒的說明書（http://www.centenary.usyd.edu.au/pdfs/shackel/SMART.pdf）。
3.1反轉錄
5’cDNA的獲得：5’CDS (5'–(T)25N-1N–3'N = A, C, G, or T; N-1 = A, G, or C) 1μl Total RNA 2μl SMART A oligo Ⅱ(5'–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3') 1μl ，ddH2O 1μl 混勻后，稍加離心，EP管用封口膜封好后，浸沒于70℃水浴2min，置冰上2min。加入以下藥品：5×First-Strand Buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl 30 mM MgCl2) 2μl ，PowerScript Reverse Transcriptase (CLONTECH公司)或MMLV Reverse Transcriptase 1μl，dNTP(RNase DNase Protase Free) 1μl， DTT(RNase DNase Protase Free) 1μl， 混勻后，稍加離心，EP管用封口膜封好后， 浸沒于42℃水浴90min。加90μl TE Buffer或ddH2O，于72℃水浴7min，以滅活反轉錄酶。
3.1 PCR反應條件的優化
PCR反應條件的優化，無非是從如下幾方面考慮：引物與模板的濃度是否匹配，退火溫度是否合適，Mg2+濃度（提高Mg2+濃度，可使引物二聚體的亮度減弱）等等。限于篇幅，不作展開討論，向大家推薦兩個網站(http://www.pebiodocs.com/pebiodocs/00101795.pdf；http://www.qiagen.com/literature/qiagennews/0297/972pcrop.pdf)，其上有詳細的說明。
4討論與展望
以上是我們結合多種試劑盒的說明書和一些網上查到資料整理成文，并加入了我們在實際操作中行之有效的方法。引物設計，當然，可以用軟件，用于RACE引物設計的原則，是按照我們實驗室慣用的方法寫成。上面提到的RNA提取的方法經過我們實驗室多人的驗證，因此，對于高等植物我們認為是比較合適的；但此方法沒有在動物和菌類中驗證過，其實，對于其它生物RNA的提取可以根據此方法稍加改進，一般來說只要操作得當，應該可以提出高質量的RNA。PCR反應條件的優化，是建立在引物設計特異性強和高質量的RNA上的，一般來說，前面兩個環節沒出問題，只要用質量較好的DNA聚合酶，克隆出全長cDNA志在必得。當然，時代在發展，人類在進步。相信在不遠的將來會的更高效、更快捷的方法出現。
參考文獻：
1王慶梅 小麥和水稻磷酸丙糖轉運器基因的克隆及其表達的組織特異性分析 中國農業大學博士學位論文2001,22-23
2 Wang Qing-mei Chen jia Wang Xue-chen et al, Cloning and expression analysis of triose phoasphate/phosphate translocator gene from wheat. Acta Bot Sin, 2002,44:67-71
3 Wang Qing-mei Chen jia Wang Xue-chen et al,Molecular cloning and expression analysis of the rice triose phosphate/phosphate translocator gene, Plant Sci 2002,162:785-790
4 廣州市方統生物科技有限公司, SMART技術回顧.2002 年07月17日 （http://www.fastwinbt.com/smart_technology.htm）
5 李 宏 王新力 植物組織RNA提取的難點及對策 生物技術通報 1999，15：36－38