摘 要：RFLP是隨著生物技術若干領域的發展而產生的一種分子標記技術, 用該技術可作出 植物的RFLP圖譜，并應用于植物遺傳和育種研究。本文簡單的對RFLP技術的基本原理、技術 步驟及其優缺點作了簡單的概況。
關鍵詞： RFLP；作物研究；應用
中圖分類號： S5．032 文獻標識碼：A 文章編號： 1008-7508（ 2007）03-0105-03
一、基本原理
限制性核酸內切酶（restriction end nuclease）能夠識別DNA雙鏈上特異的堿基序列并能 將之切斷。不同的限制性核酸內切酶有各自特異的識別序列。在同源染色體相應的DNA區段 ，用一種限制性核酸內切酶消化，由于堿基組成不同，就會產生不同長度的酶切片段，然后 用標記好的相應的DNA探針與這些片段雜交，顯示出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列 組 成是否存在差異。這一技術的基礎是通過限制性核酸內切酶切片段長度多態性來揭示DNA堿 基序 列組成的異同，因而稱為限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，縮寫為RFLP）技術。
二、RFLP技術的基本步驟
這一技術主要包括三大步驟：
1、靶DNA的準備 先將基因組DNA抽提出來，選用合適的限制性核酸內切酶酶解基因組DNA， 將酶解出來的具有各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠電泳分離，使其按片段的長短排列，將D NA片段變性后轉移至硝酸纖維膜或尼龍膜上，稱印跡（Southernb1ot）轉移，并在80℃烘烤 或用長波紫外線照射，將DNA固定在膜上。
2、核酸探針的標記 將準備作為探針的DNA片段純化（這些DNA片段可以是基因組DNA的 一個片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）標記，經純化后再用。
3、雜交顯示 將標記好的探針與硝酸纖維膜或尼龍膜上的單鏈核酸雜交，洗膜去除未雜交 的標記探針后，進行放射自顯影或加入酶的底物進行顯色反應，再對顯示出來的譜帶進行分 析。
三、RFLP技術的優點及注意的問題
1、RFLP技術的優點
第一，標記數目可以是無限的：RFLP揭示的是DNA水平自然變異，其數目幾乎是無限的。
第二，大部分標記為共顯性：表現RFLP的位點一般是單一序列，每個位點通常有兩個等位基 因(其顯性)。遵循孟德爾式遺傳，因而RFLP標記圖也可用傳統的基因標圖方法來構建。
第三，任何生育期都可預測，不受環境影響：DNA分子水平標記沒有發育階段或器官的特異 性，不受環境條件及基因互作的影響。
第四，高度變異性：每一植株都會有大量的多態性。通常只要有一次有性雜交，一個作圖群 體就能構建一個較豐富的RFLP圖譜。
2、在做RFLP分析技術時，有幾個問題是需要引起密切注意：
第一，作為檢測對象的DNA分子必須保持大分子，在抽提DNA的過程中避免人為地將DNA分子 機械性切割成小片段的DNA，否則最終顯示的RFLP圖譜可能是一種假象；
第二，在用限制性內切酶消化大分子DNA時，要使DNA被完全消化，否則所得的結果也不可靠 ；
第三，被消化的DNA濃度不能太高；
第四，電泳時要用低壓電泳；
第五，雜交前探針必須充分變性；
第六，要根據探針標記的情況以及探針與靶DNA間序列互補的程度和G、C的含量來掌握雜交 和洗膜的條件；
第七，作放射自顯影時，要根據雜交后膜上的放射活性等因素決定曝光的時間。