實驗概要
掌握合成雙鏈cDNA的RLM-RACE技術，可構建高質量的cDNA文庫。
主要試劑
1. 酶類及分子量標準
1) 高保真酶Easy-A high fidelity cloning enzyme,Merck公司Stratagene系列；
2) Taq DNA Polymerase，上海申能博彩生物技術有限公司；
3) DL 2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司。
2. 主要試劑（盒）
1) GeneRacerTM Kit，美國Invitrogen公司；
2) SuperScriptTM II Reverse Transcriptate，美國Invitrogen公司；
3) dNTP，上海申能博彩生物技術有限公司；
4) 其他試劑為國產分析純。
主要設備
1. MDF-192型超低溫冰箱，日本三洋電機株式會社；
2. CF43S超凈工作臺，Gelman公司；
3. 高速冷凍臺式離心機，Heraeus Sepatech公司；
4. Capsule HF-120型微量離心裝置，Millipore公司；
5. BL150S型電子天平，德國Sartorius公司；
6. GB 1302型天平，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司
7. YXQ.WY21-600IIR臥式高壓蒸汽消毒器，廣州市醫療設備廠；
8. DYCD-31D型水平電泳槽，北京六一儀器廠；
9. EPS1001型電泳電源，Amersham Pharmacia公司；
10. 連續可調微量移液器，德國Eppendorf公司；
11. Primus 25型PCR基因擴增儀，德國MWG公司；
12. AlphaImager 2200型凝膠圖像分析系統，Alpha Innotech公司；
13. XK96-B微型旋渦混合儀，江蘇省姜堰市新康儀器廠。
實驗材料
無菌感染期線蟲RNA
實驗步驟
1. 總RNA雙鏈cDNA的合成
按照GeneRacerTM Kit 說明書的方法RLM-RACE法合成雙鏈cDNA 。
2. RNA脫磷酸
1) 脫磷酸反應
A. 在無菌的1.5 mL離心管中依次加入下列組分建立反應體系（冰上操作）：
Total RNA | 3.6 μL | ||
10×CIP Buffer | 1 μL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 μL | ||
CIP (10U/μL) | 1 μL | ||
DEPC water | 3.4 μL | ||
Total Volume | 10 μL |
B. 輕混反應物，微漩渦，微離，50℃溫育1 h，微離后置于冰上。
2) 沉淀RNA
A. 在上述反應液中加入90 μL DEPC H2O和100 μL酚/氯仿，漩渦混勻 30秒；
B. 室溫18000 rpm高速離心5 min；
C. 小心吸取上層水相到一新的離心管內；
D. 加入2 μL（10 mg/mL）mussel glycogen ，10 μL 乙酸鈉（3 M，pH 5.2），溫和混勻，再加入220 μL 95％乙醇，微漩渦混勻；
E. 置于-80℃，10 min；或-20℃過夜；
F. 4℃條件下，18000 rpm離心20 min，獲得沉淀的RNA；
G. 小心吸棄上清液，加入500 μL 70％乙醇，上下顛倒混勻，再微漩渦；
H. 4℃，18000 rpm離心2 min，吸棄上清，再離心幾秒，用移液器徹底除去乙醇，風干；
I. 沉淀溶于8 μL DEPC H2O中，取1 μL進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. mRNA脫帽
1) 脫帽反應
A. 在無菌的1.5 mL離心管中依次加入下列組分建立反應體系（冰上操作）：
脫磷酸RNA | 7 μL | ||
10× TAP Buffer | 1 μL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 μL | ||
TAP (40U/μL) | 1 μL | ||
Total volume | 10 μL |
B. 輕混反應物，微漩渦，微離，37℃溫育1 h，微離后置于冰上。
2) 沉淀RNA
方法同1中2）
4. 脫帽mRNA與RNA Oligo的連接
1) 連接反應
A. 加7 μL脫磷酸、脫帽的RNA至GeneRacerTM RNA Oligo中，用吸頭混勻，微離收集液體；
B. 65℃溫育5 min，冰上致冷，微離；
C. 在管中依次加入下述組分建立反應體系：
10× Ligase Buffer | 1 μL | ||
10 mM ATP | 1 μL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 μL | ||
T4 RNA Ligase (5U/μL) | 1 μL | ||
Total volume | 10 μL |
D. 37℃溫育1 h，微離，冰上致冷。
2) 沉淀RNA
方法同1中2），最后加11 μL DEPC H2O，取1 μL進行電泳檢測。
5. 反轉錄第一鏈cDNA
1) 依次加入下述組分于上述10 μL連接體系中：
GeneRace Oligo dT Primer | 1 μL | ||
dNTP Mix | 1 μL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 μL |
2) 65℃溫育5 min，冰上致冷2 min，微離；
3) 依次加入下述組分于上述13 μL混合體系中：
5× First Strand Buffer | 4 μL | ||
0.1 M DTT | 1 μL | ||
RNaseOutTM (40U/μL) | 1 μL | ||
SuperScriptTM III RT (200U/μL) | 1 μL | ||
Total volume | 20 μL |
4) 吸頭混勻，微離，50℃溫育1 h；
5) 70℃，15 min終止反應，冰上冷卻2 min，微離心（室溫，18000 rpm）；
6) 混合反應物中加入1 μL的RNase H（2 U）, 37℃溫育20 min；
7) 微離，直接用于PCR擴增或-20℃貯存。
6. PCR擴增dscDNA
以反轉錄第一鏈cDNA為模板，按以下組分，建立PCR反應體系：
ddH2O | 36.5 μL | |
10×PCR buffer | 5 μL | |
dNTP Mix (10 mmol/L) | 1 μL | |
GeneRacerTM 3’ Primer (10 μmol/L) | 3 μL | |
GeneRacerTM 5’ Primer (10 μmol/L) | 3 μL | |
RT template | 1 μL | |
Easy-A high fidelity cloning enzyme | 0.5 μL | |
Total volume | 50 μL |
充分混勻，按以下程序進行PCR擴增：95℃熱變性2 min，迅速加入高保真酶，再94℃變性2 min進入循環，94℃變性30 秒，65℃退火30秒，68℃延伸2 min，25個循環后于68℃繼續延伸10 min。擴增產物以瓊脂糖凝膠電泳檢測，置于-20℃保存備用。
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