RNA的制備(mRNA的分離和RNA酶活性的控制)3

A、細胞裂解
a．單層細胞的裂解
a)吸出培養液，以7ml用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細胞培養皿內的單層細胞，重復1次，將平板置于冰上直至所有單層細胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。
b)直徑為90mm的培養皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT）
100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復合物
c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d)用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復 3－4次，剪切DNA。
c)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。

b．懸浮培養的細胞或組織單細胞懸液的裂解
a)于4℃以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其徹底分散。
b)估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內。重復3－4次，剪切DNA。
d)加蛋白酶K至終濃度為 200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
B、提取步驟
1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質。
2）用吊桶式轉頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至一個新的離心管內，加2.5倍體積用冰預次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時。
3）于0℃以5000g離心10分鐘沉淀 RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因為干的核酸沉淀很難溶解。
4）每個直徑為90mm的培養皿或每107細胞加 200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
5）分別按 10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復合物。
6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。
7）分別按 10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。
8）用等體積酚：氯仿抽提1次。
9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相， 將水相吸至另一個離心管內，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時。
10）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。
11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實驗臺放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發干凈。
12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存備用。回收DNA時，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g 離心5分鐘即可。

C、注意事項
1．測定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液離心沉淀RNA，以400水重溶， 測定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2.如果需要，可用 oligo(dT) －纖維素層析法從所制備的細胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購買試劑盒進行mRNA的純化。
3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉染的細胞中制備RNA時），必須從細胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當用這種RNA構建cDNA庫或進行引物延伸反應時應會出問題， 反轉錄過程中法染的模板DNA片段可能會與RNA雜交而充當引物，從而導致物定mRNA5’末端定位的錯誤或產生截短的 cDNA克隆。
a)步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動微量移液器反復吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個滅菌的微量離心管內。
b)用微量離心機于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。
c) 棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預冷的乙醇。混勻溶液， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機于4℃以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d)棄上清液，用 300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存備用。
回收RNA時，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數次即可。
4. 對大多數細胞株來說， 一個直徑 90mm 培養甲中培養的RNA收率為100-200μg。用異硫氰酸胍和有機溶劑提取ＲＮＡ
收集細胞，離心5000r/min ，5分鐘，棄上清，加入異硫氰酸胍變性液（異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巰基乙醇0.1mol /L）500ml，混勻，振蕩10秒，加2 mol/L醋酸鈉50ml，水飽和酚500m l和氯仿/異戊醇（49：1）100m l顛倒混合數秒鐘，冰浴15分鐘，4℃離心10,000 r/min，15分鐘，吸取上清，加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇，4℃離心10,000 r/min，10分鐘，棄上清，70%酒精洗滌一次，抽干，加35mlDEPC處理水溶解，取5ml經稀釋后紫外測定RNA提取量，其余30ml分裝，-20℃保存備用。