通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector
steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs,
siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶是RNase
III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降
解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。
在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencingcomplex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離 siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。
另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默。
實驗步驟
1. siRNA的設計
1) 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：
2) RNAi目標序列的選取原則：
A.從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結 合mRNA從而影響siRNA的效果。
B. 將潛在序列和相應的基因組數據庫（人，或者小鼠，大鼠等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。
C. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3) 陰性對照
一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。
4) 目前已證實的siRNA可以在下面的網頁找到：
2. siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。
1) 體外制備
A. 化學合成
許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3-4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
B. 體外轉錄
以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受 到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當 的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達 到的效果，從而使轉染效率更高。
最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。
不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
C. 用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混
合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA
，然后用RNaseIII (or Dicer)
在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉
染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。