一、材料與設備
1. 工人合成的 DNA 寡核苷酸（帶有 T7 啟動子）。
2. SilenceTM siRNA Construction 試劑盒（Ambion 公司）。
3. 核酸轉染試劑（如 Lipofetaminc 2000) 。
二、操作方法
1. 設計并合成兩條長 29 nt 的 DNA 寡核苷酸（作為合成 siRNA 的模板），它包含一 段 21 nt 的 siRNA 序列和一段 8 nt 的與 T7 啟動子（試劑盒提供）3' 端互補的序列（5'-CCT-GTCTC-3' )。
2. 用經 DEPC 處理的無菌水溶解合成的正、反義鏈 DNA 模板至終濃度為 100 μmol/L 首先將合成的兩條 siRNA 分子模板分別與 T7 啟動子引物雜交。反應體系如下：T7 啟動子引物 2 μl，DNA 雜交緩沖液 6 μl，siRNA 分子單鏈 DNA 模板 2 μl，總體積 10 μI。
將混合液于 70℃ 變性 5 min，然后冷卻至室溫并放置 5 min。
3. 然后采用 DNA 聚合酶 ⅠKlenow 大片段進行延伸，產生雙鏈的 siRNA 分子轉錄模板。反應體系如下：DNA 模板混合液 10 μl，10X KIenow 反應緩沖液 2 μl，10X dNTP 混合液 2 μl，無核酸酶水 4 μl，Exo-Klenow 2 μl，總體積 20 μl。
輕輕混勻后置于 37℃ 反應 30 min。
4. 對于每個 siRNA 分子應該進行兩次體外轉錄反應以分別合成 siRNA 分子的正義與反義鏈。每個轉錄反應都要按照如下的順序加入相應的成分：正義或反義 siRNA 鏈模板（步驟(3) 的反應產物）2 μl，無核酸酶水 4 μl，2X NTP 混合物 10 μl，10X T7 反應緩沖液 2 μl，T7 RNA 聚合酶 2 μl，總體積 20 μl。
將上述組分輕輕混勻后置于 37℃ 反應 2 h，然后將正義與反義 RNA 轉錄產物混合，置 37°C 水浴過夜（>16 h) ，使正義與反義RNA 單鏈分子退火形成雙鏈的 siRNA 分子。
5. 在轉錄產物中加入 DNase 和單鏈特異性的 RNase T1，37℃ 處理 2 h，以去除 DNA 模板、siRNA 引導序列以及未雜交的 RNA 分子，然后加入 400 μl 的 siRNA 結合緩沖液并置于室溫 2~5 min。
6. 在含有濾膜的 siRNA 分子制備離心柱中加入 100 μl siRNA 漂洗緩沖液（wash buffer )， 再加入步驟 (5) 獲得的 siRNA 溶液，室溫 10000 r/min 離心 1 min，棄洗液并用 500 μl 漂洗緩沖液重復洗離心柱一次。
7. 將離心柱置于一個干凈的 1.5 ml Eppendoff 離心管中，在離心柱中加入預熱到 75℃ 的無核酸酶的水，并置于室溫 2 min，然后室溫 12000 r/min，離心 2 min，洗脫液即為純化的 siRNA 分子。用紫外分光光度計確定所制備的 siRNA 溶液的濃度。
8. 取制備好的 siRNA 分子在 Lipoktaminc 2000 介導下轉染細胞，或置 -70°C 保存備用。 | 
