實驗概要
本實驗介紹了RNA樣品的轉膜(即虹吸印跡法)的操作步驟等。
主要試劑
1. 20×SSC:175.3g NaCl,88.2g檸檬酸鈉,DEPC水定容1000ml
NaOH調pH至7.0,高壓后備用。
2. 6×SSC:用20×SSC稀釋。
主要設備
1. 紫外燈
2. 80°C烤箱
3. 紫外交聯儀
實驗步驟
1.將電泳后的凝膠用蒸餾水漂洗2min,20×SSC浸泡30min以去甲醛。
2.剪一與凝膠大小相等的硝酸纖維素膜,用蒸餾水浸濕后放入20×SSC中。
3.在方盤上放置一平板,其上放置一濾紙,濾紙兩端搭入盤內浸入20×SSC中,用玻璃棒趕走濾紙和平板之間的氣泡。
4.將凝膠倒置于平臺上, 底面朝上,切掉右下角,并用保鮮膜封閉四周以防止吸水紙接觸凝膠的邊緣從而接觸平板造成液流的短路。
5.將硝酸纖維素膜放于膠上,趕走氣泡。
6.膜上放兩張濾紙,其上再放20層吸水紙。
7.吸水紙上放一平板,其上放500g左右的重物,目的是建立液體從夜池經凝膠向硝酸纖維素膜的上行通路,以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集到硝酸纖維素膜上。
8.室溫下過夜轉膜,持續16小時以上,期間換紙2-3次。
9.完成轉膜后,在紫外燈下觀察凝膠,以確定轉模是否徹底。并標記好序號、加樣孔位置和28S,18S的位置,硝酸纖維素膜和凝膠直接接觸的一面為正面。
10.用6×SSC浸泡硝酸纖維素膜5分鐘,濾紙吸干,80°C烤箱真空干燥2小時-2.5小時或紫外交聯儀下5min。如不立即進行雜交實驗,則放在干凈的濾紙中,室溫暫時保存。