[原理] 用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多,電泳遷移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,tRNA及核內小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不見的。故可通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結果。
[試劑]
1. 瓊脂糖
2. 0.1%DEPC處理的水
3. 10×電泳緩沖液
MOPS(嗎啡代丙烷磺酸)0.2mol/L
EDTA 0.01mol/L
NaAc 0.05mol/L
用2mol/L氫氧化鈉調節pH至7.0,臨用時用DEPC水稀釋。
4. 上樣緩沖液
0.5ml甲酰胺(100%)
0.2ml甲醛(37%)
0.1ml 10×電泳緩沖液
0.06ml溴酚蘭(飽和溶液)
易生物儀器庫:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物試劑庫:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
[儀器]
1.電泳儀
2.電泳槽
3.移液嘴
4.燒杯
5.微量離心管
以上器皿均分別用去污劑溶液、自來水、雙蒸水沖洗,然后用乙醇干燥,DEPC處理的水徹底沖洗。
[操作]
1. 電泳膠(50ml)制備 稱0.55克瓊脂糖加36mlDEPC處理過水,加熱溶解瓊脂糖,冷卻至60℃,加3μl溴乙錠(1g/L)、9ml 甲醛(37%)和5ml 10×電泳緩沖液,然后灌制凝膠,于室溫放置30分鐘以上使凝膠凝固。
2. RNA樣品處理 在一滅菌的微量離心管中加入2μl RNA 樣品(約4μg),加5μl上樣緩沖液,至60℃水浴15分鐘使RNA變性,再冰浴。
3. 電泳 將樣品加入加樣孔,3~4V/cm電泳,當溴酚蘭移動到膠的3/4處停止電泳。
4. 觀察結果 紫外燈下可見28S、18S和5S rRNA三條帶,觀察28S和18S二條帶是否清晰,若28S的熒光強度為18S的二倍以上,則說明RNA分子沒有降解。