1),準備工作
8, 實驗器具與材料: (1)移液槍:200ul、10ul (2)吸頭:200ul、20ul
(3)吸頭臺:放置 200ul 和 20ul 的吸頭一個 (4)EP 管 1.5ml、100ul
2),實驗器具的處理與準備
(1) 塑料制品:(包括吸頭、EP 管等)
送至高壓 3 次,試驗前將槍頭放入吸頭臺。
3), 試劑配制和準備:
(1) 雙蒸水: 100ml 鹽水瓶內裝 40ml 蒸餾水,送至高壓,后分裝到幾個 1.5mlEP 管中, -20°C中保存備用。
(2) PCR 中所需要的各種試劑 三,PCR 時注意事項:
佩戴一次性手套,同時避免戴上的一次性的手套接觸可疑污染物。
4),PCR 步驟
1, 準備 100ul EP 管
2, 依次在管中加入:(50ul 反應體系)
ddH2O
10mM dNTP
10×PCR buffer
25mM Mgcl2 (加之前要搖勻) 上游引物
下游引物
模板cDNA 1ul
3, 稍離心
4, 100°C沸水浴 1 分鐘
5, 趁熱加入 Tag 酶 0.5ul(冰上操作) 6, 再加入 50ul 液體石蠟封閉
7, 10000rmp 離心 1 分鐘
8, PCR 條件
94°C 1min
58°C 50sec
72°C 1min30sec
進行 40 個循環,然后 72°C 10min 完后 4°C保溫。
9,10000rmp 離心 5min
10,將下層水相轉入新的 0.65mlEP 管中,-20°C保存。