葉綠體RNA的體外加工與紫外交聯分析RNA
RNA的合成
l DNA模板的線性化
1．根據供應商的指導用合適的限制酶酶解含有DNA模板（如亞克隆在轉錄載體如pBluescript?（Stratagene）上的菠菜葉綠體psbA基因）的質粒（Schuster and Gruissem1991）。
2．用DNA瓊脂凝膠（Sambrook et al. 1989）分析線性化質粒以檢查酶解是否完全。
3．用乙醇沉淀DNA（Sambrook et al. 1989），并重懸DNA沉淀于水中，調整線性DNA終濃度為200μg/ml。
l DNA模板的轉錄
1．向微量離心管加入下列反應液
DNA模板 2μl（0.4μg）
反應緩沖液（5×） 4μl
DTT（40mmol/L） 0.5μl
NTP混合液（用于H－RNA或X－RNA） 2μl
RNA酶抑制劑 0.5μl（約15單位）
H2O 對H－RNA加8.5μl或對X－RNA加2.5μl
為避免DNA的亞精胺沉淀，須在室溫或37℃加各種試劑。
注：H－RNA 用于體外加工測試；X－RNA 用于UV交聯測試
NTP混合液（H－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP 0.25mmol/L UTP
NTP混合液（X－RNA用）：5 mmol/L GTP，CTP，ATP
2．向反應液中加入2μl（對H-RNA）或8μl（對X-RNA）α-[32P]UTP。
3．加0.5～1μl（即10～20單位）SP6，T3或T7聚合酶使反應終體積為20～20.5μl。
4．37℃溫育40～60分鐘。
5．加入15μl 5mol/L乙酸胺和100μl 100％乙醇沉淀RNA。
6．－20℃放置10分鐘，4℃離心10分鐘。
7．棄上清，空氣和真空干燥RNA沉淀，用7μl甲酰胺染液重懸RNA。
8．在沸水中將RNA重懸液煮3分鐘后，于冰上快速冷卻，加樣于6％的變性丙稀酰胺凝膠。
9．用Saran?膜包上凝膠，對X光片曝光約20秒。
10． 切下含有RNA的凝膠片放入1.5ml微量離心管中。
11． 在該離心管中加入：
DEPC處理過的水 180μl
DEPC處理過的乙酸鈉（3mol/L, pH5.5） 20μl
DEPC處理過的EDTA（0.25mol/L） 1μl
SDS（20％） 1μl
12． 在65℃溫育1～1.5小時或40℃下過夜使RNA從凝膠中擴散出來。
13． 將RNA液轉移入新的微量離心管中，加入500μl 100％乙醇，－20℃放置10分鐘。計數契侖科夫輻射。
14． 離心10分鐘沉淀RNA，棄去上清，真空下干燥沉淀，在進入下一操作前用合適的緩沖液重懸RNA。