實驗材料 [γ-32P」ATP合適的寡核苷酸DNA 模板l10XdNTP 混合物KLenow 片段合適的限 制性內切核酸酶X 射線膠片洗脫緩沖液tRNA 石蠟油S1 核酸酶
試劑、試劑盒 10X 激酶緩沖液PNK10X 復性緩沖液6% 聚丙烯酰胺 8mol L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料乙酸鈉4X 雜交緩沖液去離子甲酰胺S1 緩沖液S1 終止緩沖液異丙醇
儀器、耗材 垂直電泳裝置 水浴 雜交管 雜交爐
實驗步驟
一、材料與設備
1) 垂直電泳裝置
2) 水浴
3) 雜交管
4) 雜交爐
5) 用于從單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針的試劑。①10X 激酶緩沖液:400 mmol/LTris-HCl(pH7.8),100 mmol/LMgCL2，1OOmmol/L 疏基乙醇，250 ug/ml 牛血淸白蛋白儲存于 -20℃ ②[γ-32P」ATP(比活度 3000Ci/mmol)③合適的寡核苷酸：溶于蒸餾水，濃度為 l0 pmol/L, 存于 —20℃ ④ PNK（polynuclemidekinase）：多核甘酸激梅，濃度為 10 U/ul, 存于 20°C.⑤10X 復性緩沖液：100mmol/LTris-HCl (ph7.5).，l00 mmol/L MgCl2，500 mnnol/L NaCl，10O mmol/L DTT⑥DNA 模板：l mg/ml ⑦10XdNTP 混合物：5 mmol/LdATP、dCTP、dGTP、dTTP,.⑧KLenow 片段：大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的大片段，濃度為 lOU/ul 存于 -20℃,⑨合適的限制性內切核酸酶。⑩6% 聚丙烯酰胺/8mol/L 尿素溶液 (溶于 0.5XTBE) 及甲酰胺染料。?X 射線膠片：需具有合適的靈敏度.?洗脫緩沖液：50 mmol/L TrisHCl(PH7.5)，0.5 mmol/LEDTA。?3mol/L 乙酸鈉 (pH7.4)?tRNA:10 mg/ml 儲存液，儲存于-20°C
6) 雜交和 S1 分析。①4X 雜交緩沖液：1.6 mmol/LNaCl，40 mmol/LPIPES(pH6.4)。②去離子甲酰胺。③石蠟油。④S1 緩沖液：300 mmol/LNaCl30 mmol/L 乙酸鈉 (pH4.5);4.5 mmol/L 乙酸鋅，⑤S1 核酸酶：濃度為 10U/ul，儲存于-20℃。⑥S1 終止緩沖液：2.5mol/L 乙酸銨,50 mmol/LEDTA⑦異丙醇
二、操作方法
(一）單鏈 DNA 探針的制備
1. 由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針
1) 寡核苷酸探針的標記：在 0.5 ml 離心管屮加入下列組分:
寡桉苷酸 1ul
[γ-32P]ATP 10ul
l0x 激酶緩沖液 2ul
dH2O 6ul
多核苷酸激酶 1ul
將上述組分混合，于 37℃ 保溫 45 min 以標記寡核苷酸探針，最后于 95℃ 保溫 2 min 以滅活多核苷酸激酶。
2) 加入 2ul 筍鏈 DNA 模板，4ul10X 復性緩沖液，14ulH2O，依次在 65℃10 min，55℃ lOmin，37℃ lOmin 保溫
3) 加入 4ul NTP 混合物，lul Klenow 片段，室溫作用 10 min 后于 65℃15 min, 滅活Klenow 片段
4) 加入適量的 NaCl 或通過稀釋校正混合物的濃度，加人 20U 限制性內切核酸酶，37℃ 保溫 60 min
5) 加入 2ul tRNA 儲存液 A1 倍體積的 3mol/L 乙酸鈉，3 倍體積的乙醇 5 置于干冰中 10 min，12000 g 離心 15 min 以沉淀樣品
6) 加入 20ul 甲酰胺染料重懸沉淀，于 95℃ 加熱上取樣于 6% 聚丙烯酰胺/尿素凝膠 h, 至溴酚藍達到凝膠底端時結束電泳。
7) 凝膠用 X 射線感光片曝光 5 min，確定單鏈 DNA 片段的位置。切下相應的條帶，置于 500ul 洗脫緩沖液中過夜。
8) 加入 50ul 乙酸鈉 T20ugtRNA,lml 乙醇。置于一 20℃ 中 2 h,12000 g 離心 20 min
9) 將沉淀作放射活性計數后重懸干甲酰胺中按 lO5 cmp/ul), 儲茌于一 20°C。此探針劑吋用于雜交和 S1 分析
2. 從雙鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針
除下列步驟外, 其余步驟均 1「由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針'
1）先用所選的限制性內切核酸酶切割雙鏈質粒（20ug)，沉淀重懸于水中，濃度為 lmg/ml
2) 復性步驟 1「由單鏈 DNA 模板制備笮鏈 DNA 探針」屮第 2) 步需快速進行。加熱滅活多核苷酸激酶后加入 2?5ug 酶切質粒、、4ul10X 復性緩沖液、14ul 水。95°C 保溫 5 min，立即置于冰水屮，然后按步驟由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針」中第 3) 步進行。
3) 省去限制性酶切，即 1「由單鏈 DNA 模板制備單鏈 DNA 探針」中第 4) 步。
(二）雜交和 S1 核酸酶分析
1) 于 0.5 mlEppendorf 管中加入下列組分：
探針（共 10000cpm) 10ul
4X 雜交緩沖液 5ul
RNA(總 poly(A)+RNA 或離體合成的） 5ul
石蠟油 (以防止蒸發） 20ul
混勻于 37℃ 保溫 4?16 h。
2) 加 200 ul S1 緩沖液 (含 S1 核酸酶 100U)，充分混勻，置于 37°C 中 5?30 min。加入 50 ul S1 終止緩沖液終止反應，并加入 40 ug tRNA，300ul 異丙醇. 置于干冰屮 15 min,12000 g 離心 15 min
3) 用 80% 乙醇洗沉淀物，晾干后重懸于 3ul 甲酰胺染料中，95℃ 加熱 5 min，上樣于6% 聚丙烯酰胺/尿素凝膠，電泳至溴酚藍到達凝膠底端，將凝膠曝光 8?48 h
注意事項
1) 寡核苷酸長度為 20?25 個核甘酸，并與所分析的 DNA 互補。
2) 單鏈或雙鏈 DNA 模板均按標準方法制備，與雙鏈 DNA 模板制備探針相比，用單鏈 DNA 模板制備探針的優點主要是探針的得率更高，用單鏈模板制備時比活可達 1X106-1.5×106cpm
3) 為提高片段的冋收率，限制性內切核酸酶應于寡核苷酸雜交處 3＇端 200?600 個核酸的位置上進行酶切，更長的片段就難于從丙烯酰胺膠中回收。如果所用的限制性內切核酸酶切割 DNA 模板上的不止一個位點，只要它們位于探針序列以外，就不會有妨礙。
4) 所分析的 RMA 種類不同，雜交時間亦不同. 若用細胞質總 RNA 或 poly(A)+RNA 樣品，成于 37°C 至少雜交 12 h; 而用體外轉錄的 RNA 則雜交 2?4 h.
5) 分析離體轉錄的 RNA 時，S1 核酸酶作用時間町先選擇 15 min、30 min、60 min 三種，這樣可以確定將所有的單鏈核酸，包栝游離的探針，均被完全消化所需的條件，分析細胞質總 RNA 或 Poly(AVRNA 時，S1 核酸酶的最佳消化時間為 30 min，往往比消化離體轉錄的 RNA 所需的時間（15 min) 要長一些。