RNAi兩篇熱點文章回顧

自從Andrew Fire 和Craig Mello于1998年提出了RNAi概念后，怎樣將小RNA插入哺乳動物細胞成為縈繞科學家心頭的一道難題。siRNA可以破壞特定基因的信號，為實現精致的以遺傳為基礎的治療帶來希望。面臨的挑戰包括尋找不涉及其他途徑、繞過免疫反應，且穿過細胞膜的恰當機制。

面對活體生時，研究人員需要從細胞膜著手。Intradigm公司Martin Woodle說：“我們主要關心的是高電量核酸進入細胞到達有靶標活性的蛋白的困難。”

突破障礙

這篇熱點文章證明了包裝和運載siRNAs到達特異細胞靶標的各種方法。兩種方法都可以通過對小鼠靜脈注射實現離散的siRNA遞送和沉默。2004年，Woodle與同事們設計和構建了一個納米顆粒“集裝箱（shipping container）”，利用吸附在聚乙二醇（PFG）遠端的Arg-Gly-Asp (RGD)小肽配體，靶向表達整合素的腫瘤新生血管。這些納米顆粒傳遞一組以消除血管新生為目的的siRNA。他們利用納米顆粒靶向腫瘤中的新生血管和傳遞能夠消除血管新生的siRNA。

一年后，哈佛大學CBR生物醫學研究所的研究人員將靶向抗體的HIV囊膜的Fab片段與包裝精子核酸的（魚）精蛋白（protamine）連在一起。他們利用這種魚精蛋白-抗體融合蛋白（F105-P），將siRNA遞送到目的細胞中并沉默特定基因。

盡管這兩篇文章只代表了應用于人類治療的第一步，但某些信息提示這種步伐越來越快。Woodle說，依據其研究小組工作設計的人類治療措施有可能在明年走上臨床。

Woodle小組能夠抑制移植了腫瘤細胞的小鼠的血管內皮生長因子受體-2（vascular endothelial growth factor receptor-2 ，VEGF R2)。Woodle等在移植腫瘤細胞后一周內，每三天向小鼠尾靜脈血管注射40mg的siRNA納米束（nanoplex，生物通編者譯）。與未曾治療過的對照組小鼠和注射過自由siRNA（free siRNA）的小鼠相比，接受納米顆粒siRNA的小鼠，在兩周后腫瘤血管顯著縮小。表達分析結果顯示腫瘤中90％的基因被抑制。

文章作者Puthupparampil Scaria說，如果實驗順利的話，2012年有望得到切實可行的治療方案。并且，他強調“納米顆粒的魅力在于很容易研制第二種藥物；靶項其它腫瘤組織，只需改變siRNA配體。”
 
為了利用不受HIV感染的小鼠進行檢測，Lieberman研究小組將轉染HIV囊膜的B16黑素瘤細胞注射到小鼠體內。他們將靶向三種RNA途徑（c-myc、MDM2和VEGF）的siRNA結合起來，將這種融合蛋白注射到小鼠體內。結果，腫瘤體積只有對照組的1/7。siRNA對不表達HIV囊膜的腫瘤細胞沒有顯著效果。“我們已經普及了這種方法，”Lieberman說。他們還檢測了抵抗Erb2+乳腺癌細胞的抗Erb2融合蛋白。

停留在靶標

進入細胞是第一項挑戰。St. Louis大學病理系教授Ratna Ray說，她擔心高水平siRNA有毒性。俄亥俄州Lerner研究所Brian Silverman說“體內可能會引發干擾素反應”，導致干擾素刺激的基因下調。傳遞siRNA能夠潛在地激活非特異性炎癥反應，但Lieberman說她所在的研究小組重復實驗，證明融合蛋白遞送系統只是靶向目的細胞。“如果每種藥物都能靶向特定細胞，藥物的毒性就會下降，總劑量也會下降，” Lieberman說。Ray希望納米顆粒能夠提供一個緩慢釋放siRNA的系統，降低毒性的幾率。

兩支小組仍需要證明的是，這些siRNA治療劑是否有脫靶效應。2003年，Rosetta Inpharmatics公司Aimee Jackson發表了一份重要警告，Jackson研究小組設計了靶向IGF1R編碼區的16種不同的siRNA和靶向MARK14的8個siRNA，結果編碼相似核酸序列的非靶向轉錄本也出現了沉默現象，即便只有6－8個核酸匹配。比如靶向熒光素酶的siRNA，人類基因組缺少熒光素酶靶標，但siRNA仍能夠調節幾種基因的途徑。

Woodle說，脫靶的原因在于所有的實驗都是體外的，因此不足以預測siRNA在動物模型特別是人體中的功效。Scaria和Woodle說在其他VEGF途徑中，小鼠模型的siRNA相互作用最小，且沒有生理學副作用，精確靶向細胞會使該方法更有利用價值。

圖：注射過F105-P和FITC-siRNA的組織的高顯微圖片，其中細胞質中有熒光著色

參考文章：
1. R.M. Schiffelers et al., "Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle," Nucleic Acid Res, 32:e149, 2004. (Cited in 87 papers) | [PubMed]
2. E. Song et al., "Antibody-mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors," Nat Biotechnol, 23:709-17, 2005. (Cited in 90 papers) | [PubMed]
3. A.L. Jackson et al., "Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi," Nat Biotechnol, 21:635-7, 2003. | [PubMed]