最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型
不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療
體內表達
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表達載體
多數的siRNA表達載體依賴3種RNA聚合酶III 啟動子(pol
III)中的一種，操縱一段小的發夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達(1–4)。這3類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA
pol
III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol
III
啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴增，這個優點足以彌補所有缺陷，特別是當載體在實驗中確實有效的時候。
毫無疑問，siRNA表達載體的優點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達，持續數星期甚至更久。即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選，也有助于富集帶質粒的細胞。這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題。
最近多個廠家開始研究逆轉錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達，其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便。
最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達 siRNA的細胞。長期研究。
不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）
5. siRNA表達框架
siRNA表達框架(siRNA expression
cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。這個方法最早是由
Castanotto和其同事(5)采用，包括一個RNA pol III啟動子，一段發夾結構siRNA，一個RNA pol
III終止位點。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs
成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配！如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。
這個方法的主要缺點是PCR產物很難轉染到細胞中。如果有適合的新型轉染試劑能提高SEC的轉染效率的話，那問題就可以解決了。另外，沒有克隆到載體中的PCR片斷并不適于大規模制備。
Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6啟動子或者人源H1啟動子元件可供選擇，并已經過c-fos基因抑制的檢驗。
最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子
不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）
小結
運用RNAi來誘導基因表達的沉默是一種制備基因功能缺失表型的有效的新方法。