DNA芯片檢測siRNA專一性 長片斷的雙鏈RNA (dsRNA) 導入例如植物，真菌，果蠅，線蟲等生物的細胞中會引發同源mRNA的降解——這就是所謂的RNA interference (RNAi)。RNAi分兩個步驟，首先是長片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個堿基的small interfering RNAs (siRNAs)。這些siRNA隨后和相關蛋白組合成為RNA-induced silencing complex (RISC) ，這個復合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA。兩年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳動物細胞中成功引發特異基因的沉默，從此siRNA廣泛應用于這個領域。
siRNA介導的基因沉默通常要求高度的序列專一。Tuschl和同事證實siRNA和mRNA之間一個堿基的錯配都會導致基因沉默的失敗，當然這并不排除由siRNAs 引發的非特異基因沉默。siRNAs也有可能會引發一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超過30個堿基的長片斷dsRNA一樣通過引發抗病毒反應—— 一種通常由于機體對抗病毒入侵產生的反應，包括由蛋白激酶R和后繼的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻斷，以及由 RNase L激活的非特異RNA降解。
這就意味著需要在全基因組范圍內對siRNA的專一性進行檢測。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法對siRNAs的專一性在全基因組范圍內進行了檢查。
Brown和同事檢查了兩個針對外源GFP基因的siRNAs的專一性，結論是關閉外源的GFP表達不會間接影響其他細胞內源基因的表達水平。2個GFP特異的siRNAs和兩個隨機無意序列對照siRNAs分別被轉染能瞬時或者持續表達GFP的人源293細胞，結果通過GFP熒光水平檢測和FACS分析，GFP特異的siRNAs能夠沉默70%的GFP表達而對照則對GFP表達沒有影響。從轉染和沒有轉染siRNAs的細胞中分離RNA，標記后和點有36000個人類基因的cDNA 芯片雜交。其中約有20000個基因在293細胞中表達。結果表明這20000個基因中沒有一個的表達水平在轉染了特異或非特異siRNAs后發生顯著變化。
對于RNAi 特異性的另一個關注焦點是：傳遞的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫'secondary siRNAs'的產生。Transitive RNAi是在線蟲的實驗中發現的，也可能在其他生物中發生。在這個過程中，siRNAs，在變性后結合到互補的轉錄本上，通過RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3'和5'端的延伸形成新的雙鏈dsRNAs。這些dsRNAs被加工成為'secondary siRNAs'。這些二級siRNAs，如果和其他基因有同源，可以導致其他基因表達的沉默，這樣就強化了非特異基因沉默的可能性。
到目前為止，在人類基因組中沒有發現 RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)，這提示在人類細胞中可能不會發生RNAi傳遞。然而這個假設并沒有被廣泛的驗證過。Brown和同事也檢測了在人源細胞中是否存在傳遞RNAi現象。他們將兩個報告基因(luciferase and GFP)分別和常見的actin序列融合，共轉染到293細胞中。他們檢測到一個報告基因的特異的siRNAs不能導致另一個報告基因沉默。結果表明傳遞RNAi機制在人類中不存在。
研究結果支持已有的假設：siRNAs在高度序列專一的條件下發揮作用，只能導致完全互補的基因表達沉默。人類細胞不存在傳遞RNAi現象的實驗結果同樣證實這種專一性。
不過實驗受限于細胞類型和siRNAs類型，特別是外源基因的siRNAs。實驗結果仍然有待推廣到其他細胞類型，特別是內源基因的siRNAs，如果siRNAs在將來要應用于基因治療，這樣的實驗將尤為重要。
RNAi：制備siRNAs的方法
越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應用包括功能基因組學，藥物靶篩選，細胞信號傳導通路分析等等。
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
· 化學合成
· 體外轉錄
· 長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
· siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
· PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優點和缺點。哪種是最好的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優點和缺點，以及它們最適合的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs，在后面的實驗中選擇最有效的那個。網上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究
不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
2.體外轉錄
通過體外轉錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對化學合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間——畢竟，化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，圖2）
最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。
不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。
 Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting ?-Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambion's Silencer? siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 μl siPORT? Lipid (Ambion) according to the manufacturer's protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human ?-Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in >_ 95% reduction in ?-actin protein levels. |
3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。這個方法是選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響(1-4)。Ambion公司曾經用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關閉幾個基因，包括c-fos, GAPDH, La, ?-actin, 和Ku-70。
最適用于：快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型
不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療<span clear:both;="" height:10px;"="" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px; outline: 0px; font-size: 12px; background: transparent; line-height: 18px;">