本文討論的范圍包括RNA酶保護分析，northernblot，原位雜交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有，主要說一些原則，而且大部分是失敗和成功的經驗，還有小組討論結果以及各種書里七零八落看的內容，希望對大家有用。
基因表達的定義：說到基因表達，是指RNA，還是蛋白？是指mRNA還是包括風頭正旺的非編碼RNA？mRNA還有不翻譯的RNA呢。應該說轉錄水平指的是RNA水平，而蛋白應該叫翻譯水平？我們這里就特指編碼蛋白的mRNA的量的檢測吧！
方法：很多很多，我們常用的也就是RT-PCR和northern。RNA沒保護分析在國外很常用，也有半定量的功能，一次性試劑盒還能以此將一個表達簇一起分析，例如NFkB的轉錄激活譜中的8個常見基因。dot blot的最大貢獻是發展到了反向dot blot的頂峰――曾經無限時髦的基因芯片，而原位雜交的放大效應和它的假陽性使它的定量（半定量，應該根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意義不可同日而語，又難做，只有新發現的基因可以在沒有得到蛋白和抗體的情況下進行組織或者細胞定位。
先談談RT-PCR吧。關于原位雜交和dot blot大家可以和我論戰的，我曾經看到一篇公開發表的文章把dot blot稱為定量檢測，是極端錯誤的。
1、模板均一性問題：愚見采用從RNA定量的方法似不妥，不要說PCR的本身的敏感度，即便是在反轉錄就有差異，到了cDNA的分裝和用于模板的取樣，這些都不能保證準確，當然在反轉錄階段我們也經常控制在1或5ug，但這是為了再將來加樣的時候保證大致差不多，而且盡可能地利用反轉錄酶，而且RNA定量本身即使用電泳也不是那么準，更不要說分光光度計，這里說一下，我曾經看到有人說用分光光度計定量，這也不是很準確，分光光度計只是掌握大概，當然用于反轉錄足夠了，但是用于rt－pcr的定量這是不正確的，很不準的，RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了。
2、RNA制備：一般制備總RNA 即可，有時需要制備mRNA，個人認為初學者還是選擇Trizol，大量制備采用傳統的方法自己配，實際上和trozol一樣的，有時效果還好，trizaol也就是混一混，但是優點在于質量保證，使用方便，效率高，根據不同組織用trizol一般可以提到全部RNA的50%（別小看，這已經很高了）以上，有些可以到達80%。mRNA用Qiagen的柱子，別去自己做Oligo（dT）柱，太麻煩。是否用DNAseI根據基因的特點和引物的設計，能夠跨內含子的就不需要處理，處理還是很危險的哦。像這樣的微量和也用不了多少次的實驗，并且如果牽涉到樣品是無價之寶的時候，因該選好的進口試劑。談到RNA的貯存實際上主要是溫度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要說在胍里了，只－20是不夠的，至少－80，液氮最保險，想想，在低溫里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一種easy產品可用于保存標本，但在常溫也只是1天，所以低溫才是首要的，抽的時候也是這樣。
3、反轉錄：常規，取樣盡量一致，如上所述，不是為了定量，是為了半定量PCR時圖形的好看。選擇逆轉錄酶根據實驗需要，少量的可用Promega的一種1ug的酶，多的我們用invitrgen的5ug的II，當然有人說Promega和Roche的也不錯，用過，的確可以，要不Invitrogen不像當初Gibco時那么牛了，也降價打折了。反轉錄成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你還曾經72度滅活呢，是不是？要知道，雜合雙鏈比DNA雙鏈還穩定的。一般來說要擴增從反轉錄到PCR全過程的長達2kb以上的片斷是相當困難的事，很多長基因是通過隨機引物庫得到的而不是通過oligo （Td）得到的，不要說反轉錄,即使是PCR也是很困難的，不信可以從質粒里試試,至于反轉錄，就更是天方夜譚了，除了酶的效率等,還有RNA的二級結構等因素，這就要一些大公司的特殊的名貴的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.聽天由命吧。
4、半定量RT-PCR：重點，為什么是第4條？首先說明一下，半定量PCR，我是指基于凝膠成像分析的，定量PCR指實時PCR。
實驗設計：根據不同的實驗，對于不同的基因要有不同的策略，還有不同的組織，選擇不同的基因的轉錄本，選擇不同的看家基因，都各自不同，對于文獻不可照抄。
引物：對于RT－PCR重要的是引物的位置，有兩種方法，一種是上下游引物設計在跨內含子的兩個外顯子的3’端和下一個外顯子的5’端，這樣不會在基因組上擴出來。第二種是我最喜歡的，設計在兩個離得遠的外顯子上，這樣從基因組和cDNA上得到得不一樣，可以一引兩用。以上原則對單外顯子基因不使用，這是最好選擇DNAaseI處理。另外，我們有一個好習慣，就是把退火溫度設計成一樣的，這樣每次做的時候不用“三查七對”，從冰箱里拿出就坐。另外3'最后一個堿基是很重要的。
昨天看到有人問5‘端得問題，本來以為這是大家都知道的，也在這里順便說說，表達水平檢測和開放讀框沒有關系，PCR的位置不需要在讀框里，相反3’非翻譯區反而同源性最低。而且如果用的是oligo（ dT），用3端更保險。再說一句，我從不用軟件，全靠兩只眼睛看，每每用一個上午，想想還有基因組呢，只看得兩眼昏花。設計好以后，最好在查一下有沒有同源序列，尤其是一個家族的基因。
關于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的影響，當然還有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表達水平一般來說可以大致估計一種基因的翻譯產物的，有時。但二者不能混委一談。
基因組問題：如上所述，可以不用處理基因組的。但是如果是單外顯子呢？曾經有以為朋友問我，她的樣品中總是有基因組的污染，用RNA去p總能P出來。她先用trizol過兩遍，再用qiagen過兩遍，還能P出來。這是很多人碰到的問題，問題的關鍵是TAQ（除了具有DNA指導的）還有RNA指導的DNA聚合酶功能，所以是可以直接從RNA中P出來的！那就冒險讓RNA高溫一下吧，只是DNAase處理時一定小心，買大公司的，保險一些，至少也應該是takara的，買液體做好的，不要自己配，比起標本來，這時候銀子已經退居其次了。
長度：我們認為500之內比較好，不受中間可能出現的各種序列和二級結構的影響。至于eeflying說的跑的在前會彌散則可以用2％的膠就行了。我一般是250左右。目的基因和內參照之間的大小比例可以根據愛好和膠的濃度、分辨率調整的。如果是250，則相差100bp很好，如果4、500則差個200bp也可以。
內參照：每一次一定要做內參。不作內參的結果是不可信的，實際上我想大部分半定量RT－PCR本身就是不可信的，不過我做的是可信的，因為我反復摸，重復做，每次作內參照，跟自己對照，用不同的酶，不同的體系，作出同樣的結果（基因表達結果，不是條帶什么的）。
不管多少樣品，內參不作，等于說比較珠穆朗瑪峰和泰山的高度一樣，沒有海拔，泰山從地面的高度和珠穆朗瑪峰從青藏高原的高度沒什么差別。PCR一定要同時作，但是電泳可以不一起跑，沒有關系，記住，計算的是相對表達程度，再說一遍我的觀點：1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，不過我的可以。3、半定量RT-PCR應該在兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度一致，目的擴增區域的GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和Taq酶。
解釋一下：1、同一管中不是不可以，因為它有條件現同的優點，只要目的基因的擴增量和選擇的不同循環數的內參照基因的最終擴增產量大致相同就很好，很拗口吧。但是一管中的競爭抑制實在是大問題，即使對照組一致了，咱做的是差異，總有不一致的，而且PCR的放大效應會把芝麻P成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配，這不用多說了把。2、相對和準確的問題，PCR的相對定量是因為引入了內參照，所以沒有絕對定量一說，至于半定量和定量的區別不是相對和絕對的區別，而是準確和不準確的區別。一般經常搞錯的定量半定量和絕對量相對量的概念，定量半定量是指檢測準確度，而絕對量相對量是指基因在組織中的表達豐度，例如Northen雖然不是很準（Northern不是很好的金標準），主要是上樣量的原因，不管使用28s18s定還是用SB GAPDH或者β-actin都是，但是Northern得出的是絕對組織豐度，而實時熒光定量RT-PCR雖然準確（定量）但是得出的是相對表達豐度，不管使用β-actin還是用18srRNA。至于常規的通過跑電泳的所謂“定量”RT-PCR那就遠了去了。
另外，似乎有人認為要做的好，就要把條件摸得哈好的，一旦很好，就不更改，PCR條件，徨論Taq酶，竊以為實不足取，為何？我說的“摸”是指循環數和模板，如果連taq也要固定下來，其不是別人重復不了了？因為檢測的是相對量（反復強調），所以理論上在PCR過程和成像過程只要在線性期，結果應該是差不多的，為什么不說一樣是應為即使在線性期也是有差異的，大家看看文后的我們做的定量PCR的圖就知道了，在每個點的切線的斜率是不同的。
關于選擇什么作為內參照的問題，實際上沒有定論，個人認為，18s優于actin，不要跟我說GAPDH，著名的GAPDH都可以說是腫瘤相關分子了，其它還有tubulin什么的，因該差不多，實際上actin雖然相對來說很穩定的表達量，但我想在細胞分裂的過程中，需要骨架，因此actin等本身在不同細胞，不同組織、不同時期是變化的，我想，姑妄聽之。作為骨架蛋白和細胞的分裂發育是密切相關的，在不同狀態表達是不同的，不同細胞等。之所以用18s是因為相對而言核糖體RNA量相對穩定，因為它的功能是同整個基因譜有關的（負責裝配），更重要的（我想的）它在總RNA中占地比例高，所以更準確，就像你用某一種東西的數量去概括總量，應該選那種多的，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說用29根梁更準確吧，當然你用的是mRNA就另當別論了。
摸：一定要摸，關鍵是摸，摸上3、5摸總是必要的，首先分開一個一個摸，然后再放到一起摸（特指同管PCR），直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，這就是因為下面談到的線性期和平臺期的問題。
線性期和平臺期：根據上面摸的結果，選擇線性期的起始周圍的循環數作為PCR指數，這和定量PCR中的原理是一樣的，這相當于取線性期曲線的切線（是不是這樣？）。線性期似乎因該是指數期（我想的），只是因為2的冪和倍數正好一樣？不要為了后期的亮度取線性期的晚期，那樣是不準的，文后復一張自備的定量RT-PCR的圖參考就明白了。本來想把模板量單列的，在這里說了吧，模板量應該越多越好，當然是指在條件允許和不影響PCR體系的情況下，也不是指把20ul都加上，還要摸呢，對吧。一般來說2ul要比1ul好，很多人會問，過了一個循環不久一樣了么？不一樣的，這和PCR本身的原理有關，什么原理我也不懂。就像到了線性期，很多人會說，再加酶，實際上不是的，再加酶和dNTP還有引物都沒用的，其實這些本身就是過量的。
綜合上面兩點，說說下面一點：一般摸出來的結果是什么呢？個人認為，再使用1ugRNA反轉錄后用2－4ul為模板和使用5ug反轉錄用1－2ul為模板的情況下，一般目的基因很少超過30循環，著名的β－actin很少超過25循環，如果你看到有人用actin和sb GAPDH超過28－30循環的話，結果是不可信的，實際上即使超過25循環也是值得商榷的，肯定再RNA或者cDNA的步驟有問題，此時因該增加模板量，而不是增加循環數，即使目的基因要用30以上也要考慮一下。對于想脾臟這樣的組織，actin甚至可能要低于20循環，實際上在后文談到的凝膠成像儀的檢測范圍之內，應該循環數越少越好。還是那句話，并不是在指數期就可以的。
提示：另外，不是很亮（跑電泳時）并不代表沒有到平臺期，再看看我們的做的定量PCR的圖就明白了，有些基因的平臺期是達不到很高的（這不是因為熒光標記得影響），要看你摸的時候不同循環的擴增產物的量之間的關系，在相鄰之間的差異基本復合線性增長才是線性期。
一步法還是二步法：我一直不建議采用一步法，因為逆轉錄酶很貴，就做一次PCR，多可惜啊！還有RNA。而且反轉錄了之后可以做10－20次，還可以摸條件找原因。不要以為一步法是盒子，實際上是一樣的，操作沒有什么不同，還沒辦法摸條件，早該淘汰了（特指RT-PCR過程中）。對于少量的標本用1ug的反轉錄酶既可以了，或者用于預實驗都是很好的，但是P的時候要多加一點，之所以這些話總是不確定是因為還和你正在做的基因的風度有關。
關于凝膠成像分析：這是常人所未想的問題（暈倒一片），一般來說基于CCD的成像系統也有這個問題，這就是CDD本身的工作原理和軟件的質量，有的CCD是重復掃描的，有的軟件是只有256灰階的，所以要注意上樣量不要太多，當然也不要太少（以防看不到），否則會超出掃描CCD和軟件的分析范圍，這和PCR到線性期就沒有什么不同了。另外很多軟件有手動調節，這樣的軟件使用時要保持每次框起來的范圍的大小的一致性，不要造成太多的人為誤差，號召大家不要任意修改數據。此外，紫外燈管的質量、光的強度、均一性和CCD距離、焦距、分辨率都要注意。如果有錢買冷CCD當然最好了，不過其實一般用不著。實在不行的，拍了照再掃描再用photoshop分析也未嘗不可，但是那可是很不準的，中間不周太多，而且如果是熱敏打印機很容易亮度飽和的，不一定會有灰階。
PCR反應：常規PCR什么的，實際上Mg2 什么的沒有那么重要的，退火溫度什么也沒有什么的。別忘了兩對引物的退火溫度相同哦，即使在兩管中也要這樣，因為在一臺PCR儀上，如果在一管中，還要考慮4條引物之間不互補。
復孔的問題：其實用這個辦法很容易解決一些判斷問題，作三個復孔很好，這在定量PCR常用對吧?但是如上文所屬，如果模板足夠多，這步可以省去去的。
定量PCR：其關鍵在于準確和起始模板可以微量，但也只是相對定量，特指RT-PCR，這里不討論根據標準曲線檢測基因啊病毒啊什么的絕對值。為什么是準確的相對定量，我再廢話一會again，是指你不知道你的模板來源是多少，所以才用GP內參，話說回來，及時你知道多少個細胞，還有細胞生死的問題對不？這就是為什么說northern是不很準確（沒有定量PCR準確）的絕對定量，是因為northern的模板多，綜合分光光度計和28s/18s更復合實際情況些，尤其是在不同組織分布的研究中更有效。
1、 原理：畢竟，PE是定量PCR的鼻祖，而且型號也一直在推陳出新。bio－rad和roche的也是很強的，各有優勢，大家還是比一比，價格、功能、性能、服務，尤其是技術支持，有些公司的技術支持強可以幫我們很多忙的。還有最近基因公司也有一種新的不錯的。
2、 Taqman：常見原則，方法簡單，原理易懂，結果可靠。同管不同管和上面一樣的，只是還多了問你的儀器有沒有雙波長檢測濾鏡，而且雙波長有時在一管中也有影響。
3、 儀器選擇：PMT和CCD各有千秋，不要聽信一家之言。能兼容96孔板和普通PCR管的最好，96控板便宜而且一致性較好，至于邊緣效應實際上沒有那么明顯得，只要做個對照就明白了。最好能兼容各種方法、試劑和耗材的，以防后“費”無窮。速度不重要，但是其中一家公司的變性時間短也是不容小覷的優勢，對整個實驗速度還有TAQ酶的影響小，當然沒有也沒大關系，畢竟taq現在都很好。
4、 結果分析：要注意不同的探針的標記效率，分開設域值線還是放在一起要根據實際情況，即目的基因和參照基因的CT值的差距，CT（還是T，很想CS嘛）的倍數也可以改的。
總結一句，（我最在行的）半定量RT-PCR一般來說基本上是g p。