RTPCR實驗步驟

一、組織抽提：

1.       取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末

2.       移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿

3.       移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打

4.       冰上孵育5分鐘

5.       離心12,000g  4℃  5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管

6.       加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘

7.       離心<12,000g  4℃  10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管

8.       加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘

9.       離心<12,000g  4℃  5分鐘 棄去上清液

10.   加入1 ml 75%乙醇，震蕩

11.   離心<7,500g  4℃  5分鐘 棄去上清液

12.   室溫下使之變透明

13.   加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱）

14.   走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計檢測260/280吸光度比值，計算RNA濃度

二、RT反應體系（第一步）：約20分鐘

1.       65℃ 15分鐘

2.       立即放入冰浴

RT反應體系（第二步）：約2小時

1.       37℃ 1.5小時

2.       94℃ 5-10分鐘

3.       反應物保存于-20℃或進行PCR

三1、PCR反應體系：約4.5小時