1.上下游引物要保守：
為了能夠擴增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200片段進行pcr擴增。所以引物的選取也要非常的保守，最好不要有不同的堿基，若不得不有時，也必須保證引物的3’端至少有4個堿基是完全保守才可。
在設計保守引物時，要在發表序列上分別找保守一致的區域，即在發表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5個bp保守，在即在發表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5個bp保守。
5’NNNNNNN 3’
發表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
3’NNNNNNNNN 5’
2. 上下游引物的長度和Tm值：
上下游引物的長度一般為18-25bp之間，且Tm值在58-60℃之間。確保引物中GC含量在30-80%。應避免引物中多個重復的堿基出現，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現。引物的3’端最好不為G或/和C。引物3’端的5個堿基不應出現2個G或/和C。
上游引物應標記F(forword)，且在基因組的位置及長度;下游引物應標記R(reverse)，且在基因組的位置及長度。用oligo或primer preiemer軟件即可計算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超過2℃，長度相差最好不超過4bp。
3.引物的評價：
用DNAstar 軟件中的Primerselect軟件，點擊“log”菜單中的“create primer catalog”，在“name”中輸入引物的名稱、位置，按Tab鍵進入“sequence”，粘貼或輸入要分析的引物序列。選中整個序列后，在 “report”菜單下“primer self dimer”,分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個dimer，并對此引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。在“report”菜單下“primer hairpins”,分析引物的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個hairpins，并對此引物的hairpins進行評價。再選擇所需要的上下游引物，在“report”菜單下 “primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好(dG值通常為負值)，絕對值超過4.5kcal/mol易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行)。不必考慮引物與探針之間的配對與發夾結構，因為探針的Tm值非常之高。
4. 上下游引物與探針的距離(上下游引物的位置)：
理論上講，上游引物的3’端離探針的5’端為1-20bp，最佳是1bp，最近為上游引物的3’端離探針的3’端為4bp;下游引物要與探針有一定的距離，但要保證下游引物的3’端離探針的3’端最為15-150bp。整個目的片段的長度最好在50-150bp之間，最長不超過 200bp。
5. 隨機引物：
適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應。當特定mRNA 由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA 分子全部充當了cDNA 第一鏈模板，PCR 引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA 中96%來源于rRNA。
6. Oligo dT：
適用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要結合到PolyA 尾巴上，所以對RNA樣品的質量要求較高，即使有少量降解也 會使全長cDNA合成量大大減少。是一種對mRNA 特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物與其配對，僅mRNA 可被轉錄。由于Poly(A+)RNA僅占總RNA 的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。
7. 基因特異性引物：
與模板序列互補的引物，適用于目的序列已知的情況。用含目標RNA 的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR 反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。缺點是只能用于單一基因的PCR實驗。PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。
上述內容羅列了RT-PCR設計的基本原則，都是些理論的知識，大家在用軟件設計引物的時候可根據這些理論知識和軟件設計評估結果選擇最佳的上下游引物序列。