對靶序列中潛在的引物位點進行分析， 這些位點應該不會形成同源多聚體結構，也沒有明顯的形成二級結構的趨勢，不會自身互補，與基因組中的其他序列無顯著的同源性。
（1）依據寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。
（2）選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產生一種大小和堿基組成合適的產物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應在40%-60%之間。
（3）對寡核苷酸的長度和/或位置進行細調。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無明顯的互補性。作為一條經驗性的規律，一條引物上不該含有三個連續的與另一條引物互補的核苷酸。