目前已有多種方法用來研究有關細胞和組織中，基因表達產物方面的內容，這些方法主要有Northern印跡、RNase保護分析法、原位雜交、點印跡、Ｓ１核酸酶分析法及反轉錄與PCR擴增串聯的RT-PCR技術等。在這些方法中RT-PCR技術具敏感度高和應用范圍廣的特點，該技術提供給研究人員有效的進行測定轉錄產物存在與否、評估基因表達水平等方面的工作,并在不需要構建和篩選cDNA文庫的前提下，完成對cDNA片段的克隆。利用RT－PCR技術分離目的基因是目前基因操作中最有效的途徑，RT－PCR擴增產物經純化、回收、與載體重組克窿，即可實現基因的分離。
RT-PCR可由總RNA或mRNA作為模板，該技術目前有多種操作方法
一:兩步法：
(一)MMLV、MuLV(莫洛尼鼠反轉錄酶)，AMV(鳥成骨髓細胞性白血病毒反轉錄酶)/Ｔaq酶系統:在此系統中，先有反轉錄酶合成cDNA第一條鏈,隨后滅活反轉錄酶,有Taq酶合成cDNA第二條鏈和進行PCR擴增。
(二)TthDNA聚合酶/Mn,Mg離子系統。在此系統中，TthDNA聚合酶在不同離子緩沖液中表現為不同酶性質，在Mn離子緩沖液中，該酶表現為反轉錄酶性質，而在Mg離子緩沖液中又表現為聚合酶性質。因此操作中，先使系統處于Mn離子狀態，有TthDNA酶反轉錄出cDNA第一條鏈，隨后加入EGTA[乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸]鏊合Mn(因Mn的存在將抑制TthDNA
酶的聚合酶性質的發揮)，再將系統調整到Mg離子狀態，有TthDNA酶合成cDNA第二條鏈及PCR擴增。
二：一步法：
(一)TthDNA聚合酶/Ｎ－二(羥乙基)甘氨酸系統。在此系統中，Ｎ－二(羥乙基)甘氨酸的存在時，Mn離子將不具有抑制聚合酶的聚合活性，因此該酶不需用在中途添加任何試劑到反應系統中，而完成cDNA第一條鏈－cDNA第二條鏈－PCR擴增的全過程，但Mn離子的存在雖不會抑制聚合酶活性，且會降低核苷酸滲入的忠實性，因此在要求高度忠實性的實驗中,不主張使用該系統。
(二)AMV/Tfl系統。在此系統中cDNA的第一條鏈的合成有AMV反轉錄而成，而cDNA第二鏈的合成及隨后的PCR則有Tfl聚合酶催化而成。
下面我們就分別介紹二步法中的MMLV/Taq系統及一步法中的AMV/Tfl系統的詳細操作過程。
MMLV/Taq系統進行RT-PCR（二步法）
一：儀器PCR儀、離心機、取液器、電泳儀 、電泳槽 、紫外觀測儀
二：試劑PCR試劑、Taq酶、dNTP、DDT、RNA酶抑制劑
10×緩沖液 500 mMKCL100 mMTris-HCL (pH 8.3室溫)
15 mMMgCL 0.1% 明膠
三：操作
１：總RNA及mRNA的提取見http://shiyan.ebioe.com/TotalRNAIsolation.htm
２：cDNA第一條鏈的合成
（1）變性及褪火
（m）RNA 1-2μg
特異引物(100μg/ml) １μl
補水至10ul
90℃ 1min，50℃ 5min,冰浴
（2）：上述管中按下表加入各反應成分
１０×擴增緩沖液 ２μl
４種dNTP混合液 ２μl
50mM MgCL2 1μl
DTT 1ul
RNA酶抑制劑 ２０單位
MMLV 200單位
加水至 20μl
（2）：３７－42℃反應３０分鐘
（3）：于９５℃加熱５分鐘，滅活反轉錄酶
3：PCR擴增
按下表加入：
１0×擴增緩沖液 5ul
dNTP 2ul
上游寡核苷酸引物 10-50pmol
下游寡核苷酸引物 10-50pmol
Taq聚合酶 2.5u
加上至總體積 50μl
加礦物油 50μl
4：設定參數，PCR擴增
AMV/Tfl系統（一步法）
在本系統中一個反應管、二種酶系統為分析RNA尤其是衡量RNA提供了靈敏度高、快捷便利、可重復性強的方法。由AMV催化cDNA第一鏈的反轉合成;Tfl催化合成cDNA的第二鏈及進行PCR的擴增反應。該系統提供單一的反應緩沖液體系,而不需要在RNA反轉和PCR擴增之間添加其他緩沖液。這樣既簡化了操作步驟,又降低了RNA模板被污染的可能性。另外該系統的操作中,AMV的反轉溫度為48℃,這又在最大程度上防止了RNA二級結構的形成。
一:儀器：同上
二：試劑：
1：同上
2：Access RT-PCR試劑盒