六、需購置的Rt-PCR材料：
（生工. Tel. 2236106.）
Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00
dNTP: 1支
oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega
M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)
RNasin: 1支 110
-- -20℃
DEPC 5g 110.00
Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies
-- 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威
（1543. 994. 697. 515. 377. 231）
七、引物合成
正義：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′
反義：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′
2、 par-4:
正義：5′-GGGACCTCGGAACTCAAC-3′
反義：5′-TGTATCTGCCTGGGACTG-3′
3、退火溫度計算
2（A+T）+4（G+C）
正反義平均數，再上下波動度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分裝好
5、引物稀釋：
加DEPC水量為（μl）
= ? nmol / OD × 管上所標OD數×100
是為10p mol / μl 濃度的引物溶液
八、PCR產物電泳
先將1-10μl左右PCR產物，加已點在紙上的溴酸蘭，反復吸打混勻后進行電泳，一般電流為10mA，電源100V，電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結果掃描打印。
九、幾個注意點：
1、逆轉錄的關鍵步驟是立即冰水浴？
2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。
3、RNA抽提前，打開離心機預冷。
TRIzol法抽提總RNA
細胞1×107
組織100mg
↓
加1mlTRIzol
細胞用1ml加樣器吹至液體澄清且無細胞團塊
↓
勻漿（要徹底，后轉至EP管）
（組織勻漿量>100mg時分裝1ml/每EP管）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
加氯仿1/5體積（0.2ml）（必須按總體積的1/5）
↓
顛倒混勻10下，室溫5分鐘
↓
4℃，離心12000g，15分鐘
↓
轉上層水相（約400μl）于另一1.5mlEP管中
↓
加等體積異丙醇（約400μl），混勻室溫10分鐘
↓
4℃，離心12000g，10分鐘
↓
棄上清
↓
加冰預冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml
↓
4℃ 離心7500g，5分鐘
↓
棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥）
↓
溶于DEPC水中至 20μl（10μl-20μl）
（可在55-60℃水中，<10分鐘助溶）