注：
1、RNA若用于核酸轉移應溶解于樣本緩沖液中，否則DEPC溶解
2、細胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60℃放置至少一個月（甚至可一年以上）
3、RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年
兩步法RT-PCR
（第一步：逆轉錄反應）
試劑 濃度 體積 終濃度
RNA 23μl(11.5μl)
Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl
（稀釋10倍后用）
↓
混勻，離心，70℃ 5min
↓
立即冰水浴，稍離心
↓
試劑 濃度 體積 終濃度
M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1×
dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM
RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ
M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U
總體積40μl（20μl）
↓
混勻，離心，42℃ 60min
↓
95℃ 10min（破壞MLV）
↓
4℃保存
兩步法RT-PCR
（第二步：PCR反應）
總體積20μl(50μl)
試劑 濃度 體積 終濃度
Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1×
MgCl2 25mM 1.2μl (3μl) 1.5mM
dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) <200uM
上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol
cDNA 模板 X (?) (1-10μl)
DEPC水 20μl-4.3μl-X
Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl
↓
混勻
↓
97℃，5分鐘
↓
立即冰水浴
↓
混勻
↓
95℃ 5分 預變性
94℃ 30秒 變性
X℃ 40秒 退火
72℃ 30秒 延伸
72℃ 7分 終末延伸
28-36循環，4℃保溫
三、電泳：
加1-10μl PCR產物+溴芬蘭（1-2.5μl）混勻，加樣，電泳。
注意：Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作時置于冰上。DNTP勿反復凍融。