Science：提升你的顯微鏡

Science：提升你的顯微鏡

　　一個科學家能否顯現出實驗材料上錯綜復雜的細節，取決于他們使用顯微鏡的能力。“一個古老的諺語是，好的顯微鏡取決于它各部分的總和。”美國馬薩諸塞州坎布里奇市哈佛生物影像中心成像部主任Douglas Richardson說，“如果其中一個組件（目鏡、檢測器或任何其他組件）比其余的質量差，最終會影響到其成像。”他接著說，“你需要所有部分的功能都達到其最高水平。”

　　科學家能夠輕松地構想出他們理想的顯微鏡系統，但要想真做出來，卻需要更多的工作。正如Richardson所說：“選擇哪些組件放進你的系統，將是一個漫長的過程，需要根據你自身的應用（需求）定制。”

　　如今，可供選擇的組件如此之多，每個科學家都需要選擇自己的必備之物，通常是基于價格的考慮。當被問到是否有特定組件比其他組件更重要時，Richardson說，“對于任何系統而言，最重要的組件就是物鏡。”他接著說，“當我們看到一個系統，我首先會考慮的是：可以用什么物鏡？哪種會對顯微鏡所需完成的應用來說最有效？”因此Richardson會將資金首先用于物鏡。其次，他會選一個好的檢測器。

　　你如何構建你的顯微鏡完全取決于你的使用計劃。例如，某些類型的照相機在不同的光線條件下比其他的類型更好。同樣，顯微鏡載物臺也能解決特殊的需求，如移動性或者環境約束。為了達到最優結果，需要將配合較好的部分組合起來，以達到你的實驗所需要的標準。

　　連接正確的照相機

　　許多生物科學家都將他們的顯微鏡與照相機相連以進行記錄并分析圖像。如今的顯微照相機，已經由電傳感器取代了膠片。其中最早的一種傳感器是電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD），它利用像素矩陣捕獲光線并將其轉換為電信號。許多制造商仍在使用這種類型的傳感器，它們是極其可靠的。

　　成本較低的互補金屬氧化半導體（complementary metal-oxide semiconductor，CMOS）則來源于集成電路產業。這種傳感器也將光轉換為電信號，但它需要在傳感器上有更多的電路，這樣就占用了感應的空間，因此這項技術通常比不上CCD的光線敏感度。然而，由于像素是集中檢測而非單個檢測，CMOS傳感器可以得到比CCD傳感器更快的幀率（每秒的圖像數）。CMOS的新版本——科學CMOS（scientific CMOS ，sCMOS），通過在維持速度的情況下提供更強的敏感性，解決了該技術的缺陷。

　　然而，不同的應用常常決定了照相機哪一種獨特的性能是必要的。“如果你在構建一種簡單的顯微鏡，只為拍攝一個被H&E（蘇木精和伊紅染料）染色的樣品照片，你不需要過分奢侈的照相機。”如果你需要更高的成像速率或者檢測弱熒光信號的能力，Richardson說，“你可能會從一臺價值2000美元的照相機升級到一臺價值20000或30000美元的照相機。”前者可能是一個高端消費型CCD照相機，而后者則可能是個sCMOS照相機。

　　制造商也在繼續通過各種感應器在顯微照相機中謀求新的發展。例如，位于德國奧伯考亨的蔡司（Carl Zeiss）顯微鏡成像產品市場經理Scott Olenych指出，他們公司新推出的Axiocam 506系統，使用具有16毫米對角線長度的CCD傳感器。與使用11毫米或更短對角線的傳感器的照相機相比，Axiocam 506可以獲得更廣闊的視野。此外，這種照相機提供彩色或單色版本，具有能夠控制圖像獲取的軟件，并提供了在圖像上增加標記或比例尺等工具。Olenych這樣描述這個軟件：“人們通常覺得用起來非常簡單。”這一點確實很重要，原因正如Olenych所說，“你在電腦上與顯微鏡互動，因此軟件決定了整體的體驗。”

　　科學家在為顯微鏡配備相機時，可以從其他裝載了16毫米對角線CCD的選擇中做決定，例如由加拿大不列顛哥倫比亞省薩里市QImaging公司制造的Retiga 6000。QImaging的產品經理Chris Ryan介紹，這一照相機“的服務對象是那些想要掃描整張載玻片或同時監測大群細胞（如高容量篩選）的客戶。”

　　例如，在熒光成像中，科學家考慮的是敏感性和分辨性，Ryan說。敏感性決定著可以檢測出的最弱的熒光信號，而分辨性則顯示了圖像可以識別的最細微的特征。“那些特征是照相機與物鏡的組合。”Ryan說。

　　在某些情況下，生物科學家可能傾向于具有一系列特征的照相機。若是如此，他們可能會選擇sCMOS的照相機。例如，愛爾蘭貝爾法斯特Andor技術公司的生命科學應用專家Orla Hanrahan提到了Andor的Zyla 4.2系統。“這臺儀器可以提供敏感性、速度和廣闊的視野，就像一臺全能的照相機。”Hanrahan說。

　　然而，在低光成像中，研究者可能更傾向于電子倍增電荷偶聯（electron-multiplying charge-coupled device ，EMCCD）的照相機。EMCCD包括了能將常規CCD的輸出結果倍增的電荷設備。因此，EMCCD可以檢測微弱的信號。例如，美國亞利桑那州圖森Photometrics公司的Evolve 512 Delta系統使用的就是EMCCD傳感器。然而，Photometrics的產品經理Rachit Mohindra卻指出了其中的缺點：“在如此低光水平下工作，EMCCD照相機使用的傳感器像素更大，會在給定的范圍內收集更多的光，因此你看不到更精準的細節。”

　　維持樣品活性

　　如今的生物科學家經常對活體細胞進行成像。傳統上，科學家大多在觀測死的細胞，這些細胞的制作過程會使樣品非常健壯，能夠在不受特殊關照的情況下保存若干年。與之相比，活細胞必須得到精心培養（維持在恰當的環境和溫度下）以使它們保持活性。美國加州卡爾斯巴德的生命科技公司高級研發經理Michael O'Grady說：“為了得到清晰的圖像，你需要保持細胞的健康。”

　　為此，科學家必須在觀測活細胞時維持特殊的環境條件。為了決定哪個設備為特殊的應用提供最優的條件，科學家可以咨詢專家，例如美國伊利諾伊州維斯塔蒙特市McCrone顯微鏡及配件公司的儀器銷售部總裁與主任Jeffrey D. McGinn。他說：“當有人聯系到我們，我們會進行一些需求評估的問卷，例如咨詢客戶想要觀測的樣品類型，以及樣品是否需要置于某種特定環境中。”因此，他可能建議配置一個溫度控制的平臺系統，如英國薩里市Linkam科學儀器公司所提供的平臺。這些平臺能夠保持樣品在-196℃~1,500℃的溫度范圍。其中一個應用就需要加熱，McGinn指向制藥業。他說：“當你加熱藥物產品時，可能會經過多態的轉變。其中一些會有不同的反應。”所以藥學科學家可能要將樣品暴露在一系列的溫度范圍中，以尋找轉變點。在另一個例子中，研究者可能僅需要在成像實驗中讓細胞樣品維持在體溫環境中。

　　一些應用甚至需要更高水平的環境控制，科學家可以利用由先進顯微鏡公司（近期被生命科技公司收購，后者又被賽默飛世爾科技公司收購）提供的平臺式孵育器獲得，其中包括一個可控環境的培養室。“這一設備本質上是EVOS熒光顯微鏡的插件。”生命科技公司產品經理Hans Beernink說，“它被整合到顯微鏡中，由軟件所控制。”它可以控制其溫度、濕度、甚至是氣體，如氧氣。

　　保持聚焦

　　除了要保持細胞的健康狀態，活細胞成像也帶來了其他獨特的挑戰。一些科學家必須克服光學上的障礙，另一些則偏向于機械問題。

　　獨特的光學因子開始在活細胞成像中起作用。由于物鏡最初是為固定樣品所設計的，與活細胞相比具有不同的光學特性，這就造成了對于新的顯微鏡解決方法的需求。加拿大安大略省列治文山的奧林巴斯加拿大公司科學儀器部市場經理Andrew Millar說：“我們有機硅浸漬的物鏡就是為成像活細胞所設計的。”他接著說，“當使用有機硅浸沒光學后，從活細胞收集的成像更加明亮，分辨率更高。”這些物鏡可以達到30倍、40倍和60倍，可以配在任何奧林巴斯的顯微鏡上。因為有機硅浸漬介質的折射參數非常類似于活細胞的折射參數，它們提高了成像的質量。

　　活細胞成像技術包含了廣泛的應用，其中有些卻十分特殊。例如，在電生理學領域，一旦你將玻璃電極插入所需的神經元中，你不希望任何東西碰到它，擔心會突然地終止你的記錄。但是如果你想要看一下旁邊的物體，甚至是放入第二個電極？你不能夠移動顯微鏡載物臺，但是有些技術卻可以讓你將物鏡重新定位，如佛蒙特州威利斯頓市MBF生物科技公司的徑向移動物鏡（Radially Moving Objective, RMO）。“它能夠使物鏡在x和y方向上移動。”該公司總裁 Jack Glaser介紹，“樣品固定不動，通過物鏡移動來掃描不同的點。”Glaser接著說，RMO能夠配合大部分的顯微鏡和物鏡。“你只需要轉動鏡頭轉輪，換成RMO，旋緊旋鈕，就能夠使用了。”Glaser解釋道。RMO配備的控制盒能夠讓計算機移動物鏡。

　　熒光的特性

　　無論科學家是在觀測活細胞或固定樣品，控制照明對于顯微實驗來說都是一個重要的方面，特別是對于如今需要多重激光來點亮樣品中不同熒光標記的成像技術。“人們對他們的實驗有自身的偏好和需求。”總部設在紐約州梅爾維爾的尼康儀器公司美洲市場和產品部總經理Stephen T. Ross說。

　　為了幫助他們實現這些需求，尼康為自己的Ti倒置顯微鏡研發了新的組件。例如，尼康的LU-N激光單元能夠裝載多達8種激光，范圍是356~756納米。“這些激光單元也能夠提供多達7種不同的輸出，能夠與多種儀器相連，如熒光成像的光激活系統。”Ross說，“此外，這是個固態的激光系統，當它從盒子中取出時，不需要反射鏡或者調解裝置。”

　　尼康研發的L-Apps系統組件與LU-N系統一并推出。“這些應用組件能夠通過我們的軟件與LU-N進行協同工作。” Ross說，“這就可以接受復雜的實驗，使得它們能夠為不同專業水平的人們所使用。”當照亮活細胞時，激光會損傷樣品。因此對于照明的控制就派上了用場。

　　為了真正減輕熒光成像中激光照明的潛在損傷，科學家可以使用雙光子顯微鏡。它通過一次性利用兩個光子激活熒光分子，來降低光對于樣品的影響，每個只攜帶一個光子能量需求的約一半。為了進一步減少組織損傷，科學家可以使用能夠造成脈沖非常短的激光，這也能夠減少樣品應用的能量。如今這種成像最快的激光能夠在飛秒（一秒的千萬億分之一）的范圍中產生脈沖。

　　當問及制造大多數生命科學實驗室可以使用的飛秒激光時，奧地利維也納Femtolasers Produktions公司的總裁Andreas Stingl提到了三件事：易于使用、一萬小時的生命周期和強大的構造。他說：“目前，能夠在80兆赫的重復率下操作、并能在100飛秒的范圍內傳送脈沖的可調節鈦藍寶石振蕩器，是雙光子顯微鏡使用的標準資源。”除了造成傷害較少之外，飛秒脈沖能夠比長脈沖穿透更深的組織。Stingl舉例表示，“在相同的平均功率下，Sub-20飛秒脈沖比120飛秒脈沖多出160%的穿透深度。”

　　這種“分鐘—飛秒”的轉變對于成像的影響，揭示了當今顯微鏡技術的精確性。但是也不應過度關注如此微小的參數，以至于忽略了將所有正確的顯微鏡組件搭配在一起的整體需求。每一部分都很重要，它們之間的相互作用也是如此。這些都必須整合進一個系統，以滿足每個科學家的需求。