Science：CRISPR女神發表新成果

Jennifer Doudna(左)

　　來自加州大學伯克利分校、德國馬克斯普朗克生物物理化學研究所的研究人員揭示出了為識別靶DNA，預先組織形成的一種Cas9-導向RNA(gRNA)復合物的構象。這項研究發布在近期的《科學》(Science)雜志上。

　　文章的通訊作者是加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士。Doudna是CRISPR技術的共同開發者，曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”（Breakthrough Prize），是CRISPRZL的有力競爭者。

　　CRISPR序列源于原核生物的一種獲得性免疫系統，協同Cas（CRISPR-associated）蛋白家族參與抵抗噬菌體或其他病毒的二次感染，廣泛存在于細菌和古細菌中。目前已發現三種不同類型的CRISPR/ Cas系統，比較常見的是II型CRISPR/ Cas獲得性免疫系統。

　　在II型CRISPR/ Cas系統中，成熟的crRNA與反式激活的crRNA（tracrRNA）形成雙鏈RNA結構，它指導CRISPR相關蛋白Cas9在目標DNA上引入雙鏈斷裂。在與crRNA指導序列互補的位點，Cas9 HNH核酸酶結構域和Cas9 RuvC核酸酶結構域分別切割與gRNA互補和非互補鏈中的雙鏈DNA(dsDNA)序列。

　　通過操控融合crRNA和tracrRNA序列融合為單導向RNA(sgRNA),現研究人員已將II型CRISPR/ Cas系統改造成為了一種適用于在培養細胞和整個生物體中實現定向修飾（刪除、添加、激活、抑制）特定基因序列的新型基因組編輯工具。現已在人類、小鼠、斑馬魚、酵母、細菌、果蠅，線蟲、擬南芥等物種中得到廣泛。

　　無論是在細菌免疫還是在基因組工程改造應用中Cas9發揮作用均依賴于精確地選擇DNA目標。而選擇目標依賴于20nt gRNA序列與DNA之間的堿基配對，以及靶向位點附近存在的2-4bp“ PAM ”（protospacer adjacent motif）短 DNA 序列。crRNAs導向片段內一段“種子”序列與靶DNA互補對于DNA識別和切割至關重要。在II型CRISPR系統中，Cas9通過識別PAM以及搜尋在PAM附近，與gRNA片段3′末端10-12nt“種子”序列互補的DNA來結合靶向DNA。

　　在這篇Science文章中，研究人員報告稱他們解析了具有催化活性的化膿鏈球菌Cas9與85-nt sgRNA形成復合物的晶體結構，晶體結構的分辨率達到了2.9埃，由此揭示出了一種不同于apo和DNA結合狀態的獨特構象。研究人員證實在這一構象中識別DNA必需的10nt的RNA“種子”序列呈現一種preordered形態。由此這一gRNA“種子區域”為啟動識別DNA靶序列做好了準備。