實驗方法原理 DNA 可以同時從瓊脂糖兩面向兩張膜上轉移。當需要用兩種不同的探針分析相同的限制性內切核酸酶酶切片段時，這種方法是很有用的。DNA 片段轉移速率較快，但是由于凝膠中的液體從兩側同時流出導致脫水速率太快，所以轉移效率較低。當靶序列的濃度較高時這種方法效率最高，例如分析克隆的 DNA 時（質粒、噬菌體、黏粒、PAC 或 BAC ) 或者不太復雜的基因組時。用這種方法轉移的哺乳動物的基因組 DNA 太少以至不能重復或及時地檢測到單拷貝序列雜交信號。
實驗材料 限制性內切核酸酶DNA 分子標記物靶 DNA
試劑、試劑盒 變性溶液HCl中和緩沖液中性轉移緩沖液SSC蔗糖凝膠上樣緩沖液SYBR Gold 或溴化乙錠
儀器、耗材 無溴化乙錠的瓊脂糖凝膠交聯設備玻璃烤盤尼龍或硝酸纖維素膜旋轉振蕩平臺厚的吸水紙熒光標記的透明尺
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液及溶液
變性溶液（1.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L NaOH）
HCl ( 0.2 mol/L) 應用于 DNA 脫嘌呤
中和緩沖液（1 mol/L Tris ( pH 7.4)，1.5 mol/L NaCl）
中性轉移緩沖液（10X SSC)
6X SSC
6X 蔗糖凝膠上樣緩沖液
SYBR Gold 或溴化乙錠
2. 酶及緩沖液
適當的限制性內切核酸酶
3. 凝膠
用無溴化乙錠的 0.5X TBE 或 1X TAE 配制的 0.7% 的瓊脂糖凝膠
4. 核酸及寡聚核苷酸
DNA 分子標記物
靶 DNA
5. 專用設備
交聯設備（例如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-Rad), 或者微波爐，或真空爐
玻璃烤盤
玻璃板
尼龍或硝酸纖維素膜
旋轉振蕩平臺
厚的吸水紙（例如，Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)
熒光標記的透明尺
重物（400 g )
二、方法
1. 消化 DNA 并根據方案“Southern印跡（毛細管法將 DNA 轉移到膜上）”步驟 1~3 所述凝膠電泳分離 DNA 片段。
2. 凝膠電泳分離 DNA 以后，用溴化乙錠或 SYBR Gold 染色并照相。將一透明熒光尺放在凝膠邊緣以便從照片上根據遷移距離直接讀出 DNA 條帶的大小。在中性條件下準備轉移用的凝膠。
3. 用干凈的解剖刀或切紙機切下兩張每邊都比凝膠大 1~2 mm 的尼龍或硝酸纖維素膜。切下膜的一角，使之與凝膠的切角對應。切 4 張與膜同樣大小的厚吸水紙。
4. 將膜漂浮于盛有去離子水的皿中直到膜從下往上完全浸濕，然后將膜浸入 10 X SSC 中至少 5 min。
5. 每層都用吸管趕走氣泡，尤其是膜與凝膠之間。將一張膜放在兩張潮濕的吸水紙上。將凝膠放在膜上，二者切去的一角對齊。立即將另一張膜放在膠的另一面，然后是兩張潮濕的吸水紙。
6. 將夾在一起的吸水紙、膜以及凝膠放到 5~10 cm 高的一疊紙巾上。上面再放置一疊紙巾。將一塊玻璃板放在紙巾上并用 400 g 重物壓實。
7. 2~4 h 之后，移去吸水紙及紙巾。將凝膠和膜轉移到干燥的吸水紙上，用一支極軟鉛筆或圓珠筆標記凝膠加樣孔的近似位置。
8. 將 DNA 固定于膜上。
9. 直接用探針與固定的 DNA 雜交。
任何不立即用于雜交的膜都應當充分干燥，松弛地包于鋁箔紙或吸水紙中，室溫下最好保存在真空條件。