Southern印跡實驗——印跡法

DNA

HClNaClTrisNaOHSSC溴化乙錠

電泳儀紫外透射儀

一、向上毛細管轉移法的轉移疊層系統：

圖一、向上毛細管轉移法的轉移疊層系統，A表示海綿法，B表示濾紙橋法
 

二、實驗步驟

1.  用適當的限制性內切酶消化DNA，與合適的DNA分子量標準一起進行瓊脂糖凝膠電泳。

2.  用溴化乙錠染色，在凝膠的側沿放一把直尺進行照相，便于以后識別電泳帶在膜上的位置。

3.  按如下方法處理凝膠，室溫下輕輕搖動，要確保凝膠被完全覆蓋。

（1）蒸餾水：約10倍于凝膠體積的0.25 mol/l HCl，30 min。

（2）蒸餾水：約10倍體積的變性液，20 min，2次。

（3）蒸餾水：約10倍體積的中和液，20 min，2次。

4.  如圖一所示安裝轉移疊層系統，其各層組成依次為

（1）海綿或固體支持物，置于一個盛有足以浸沒海綿一半高度的20XSSC的平皿中。

（2）1張Whatman 3 MM 濾紙橋，3張Whatman 3 MM 濾紙，凝膠，包裹于凝膠邊緣的塑料薄膜。

（3）1張在蒸餾水中平衡過的尼龍膜（或用蒸餾水浸濕，然后在20XSSC中平衡10 min 的硝酸纖維素膜），5張 Whatman濾紙及一疊4 cm 紙巾塔。

（4）每加一層均將其用20XSSC浸濕，并用一根10 ml 玻璃吸管在其表面小心地滾動以除去所有氣泡。

5.  將一塊玻璃平板放于疊層上面，其上加一重0.2~0.4 kg 的重物以使各層固定，放置過夜。

6.  取出雜交膜，用鉛筆在膜上標記樣品孔的位置，井切去一角以標示方向。

7.  用2×SSC漂洗雜交膜，然后將其放在一張Whatman 3 MM 濾紙上，使其完全干燥。

8.  將尼龍膜置于可透過紫外線的塑料夾層中，帶有DNA的一面朝下，置于紫外透射儀（波長254 nm）上進行照射。

9.  膜干燥后可夾在2張Whatman 3 MM 濾紙之間，室溫下放置數月。