SouthernBlot實驗流程（包括原理／細節）1

一、DNA 的提取
人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨后用酚、氯仿抽提，經RNase 處理和純化來提取DNA。
(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉淀。
(2)加入2ml細胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K 至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye終濃度為0.5%，混勻裂解蛋白呈糊狀。

(3)50℃水浴2h，轉入37℃水浴過夜，次日加入等體積飽和酚，輕輕顛倒混勻，以防止DNA斷裂，約3min。

12000r/min 離心15分鐘（室溫）
(4)取水相，再加入等體積酚/氯仿(1:1),同樣顛倒混勻，去除蛋白質
12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(5)再重復步驟(4)，再用等體積酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等體積氯仿，去除酚及蛋白質，顛倒混勻
12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(7)取水相，加入2倍體積的預冷無水乙醇，沉淀DNA，混勻-20℃放置1小時
12000 r/min 離心15分鐘（室溫）
(8)用70%乙醇洗滌一次，按上法離心將沉淀真空干燥10分鐘。
(9)加入RNase A至終濃度100mg/L，37℃水浴消化1小時，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K 至終濃度0.4g/L、Sarkosye至終濃度0.5%，混勻，50℃水浴2小時，加入NaAC至終濃度10mmol/L。
(11)用等體積飽和酚各抽提一次，步驟同前。
(12)吸上清，加入氯仿/異戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍體積預冷無水乙醇，-20℃ 1小時。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分鐘后溶于少量TE中，4℃貯存。

Southern對DNA的質量要求比較高，一般來說，高質量DNA 樣品需具備以下幾點：
① DNA 完整性好；
② DNA 純度高；
③ 勿用TE 溶解DNA；
④ DNA 濃度不低于0.7ug/ul，雜交需模板DNA 約20ug/泳道/次
二、引物設計
三、DNA 檢測

1、DNA濃度的測定
DNA濃度用紫外分光光度計測定，核酸的光吸收值位于波長260nm處，蛋白質則位于280nm，分別測定后，其OD260/OD280的比值應大于 1.8.低于此值，說明DNA中仍殘留較多的蛋白質，此時可用酚、氯仿繼續抽提純化。若比值大于1.9表明DNA鏈破壞，斷裂嚴重，已成為小分子，因此操作應輕柔。
取少許DNA溶液，經紫外線掃描，吸收峰值位于波長260nm處，其純度應為OD260/OD280=1.8,

OD260值為1的溶液大約含50μg/mL DNA，故DNA的濃度 (μg/mL)=OD260值×50μg/mL×稀釋倍數。DNA總量(μg)=DNA濃度(μg/mL)×總體積 (mL)
2、DNA分子量的測定
DNA分子量大小測定，可用含溴化乙錠的1%瓊脂凝膠電泳法測定，根據加入標準品片斷的電泳遷移距離計算樣品片斷分子量大小，此技術還可用作分離基因組 DNA，進一步進行Southern吸印分析。
四、探針制備（以PCR 標記方法為例）
1、標記原理
Dig-dUTP 在Taq DNA 聚合酶的作用下，經基因特異的引物PCR 指數擴增，可摻入到新合成的DNA 分子中，從而完成DNA 探針的標記。在延伸反應中，每20~25 個核苷可有一個Dig-dUTP 分子摻入到新合成的DNA 鏈中。2、操作步驟
1）探針標記
注意：在探針標記前，必須用普通PCR 優化反應條件（試劑盒中提供了過量的Taq DNA 聚合酶 及其Buffer，建議用于條件優化），包括引物、退火溫度、延伸時間、模板量等，設定好最佳反應條件。任何非特異擴增可能導致高的雜交背景甚至假陽性。
在標記反應的同時，用普通dNTP 做一個相同體系的非標記PCR 擴增。
擴增體系：

PCR擴增：
95℃ 5min;[ 95℃ 30sec,60℃ 35sec, 72℃ 30sec;] 72℃ 5min;
30 cycles