T4DNA聚合酶實驗

DNA

Trish·Cl dNTP MgCl2 BSA DTT

水浴鍋

一、50 μl 反應體積：

（1）50 mmol/l  Tris·Cl，pH8.0

（2）5 mmol/l  MgCl2

（3）5mmol/l  DTT

（4）100 μmol/l  4dNTP混合液

（5）50 μg/ml  BSA

（6）0.1 U  T4DNA聚合酶

（7）2 μg  DNA

（8）11℃溫育20 min，加入2 μl 0.5 mol/l EDTA或75℃加熱10 min以終止反應。

（9）反應體枳、4種dNTp的濃度、反應溫度可依具體應用而變。

二、dNTp濃度的效應

1.  高濃度的dNTP在通常實驗下可以增加聚合酶活性對外切酶活性的比值。

2.  在標記實驗中，標記了dNTP的濃度降至1到2 μmol/l，但標記dNTP不能低于1 μmol/l 濃度，否則當dNTP耗竭時，會導致其外切酶活性對的降解。

三、度的效應

用T4 DNA聚合酶標記3’末端時，反應溫度保持在11℃，在較髙溫度下，其外切酶活性易降解DNA模板。

一、緩沖系統的相容性

許多限制性內切酶能在T4 DNA聚合酶的緩沖系統進行切割反應，同時，T4 DNA 聚合酶也能直接使用。

二、應用

1.  放射性標記DNA片段的3’末端，含5’凸出端的DNA片段及濃度為1~2 μmol/l 的適當［α-32P］dNTP，在11℃溫育20 min。

2.  選擇性及無選擇標記線性化雙鏈DNA分子的3’宋端，即所謂的“置換合成”。雙鏈 DNA片段在dNTP存在下與T4 聚合酶溫育，其3’末瑞的外切酶活性導致從 3’末端降解DNA，當補加4種dNTP后，可激活其聚合酶活性，延伸DNA鏌板的3’末端。在T4 DNA聚合酶的外切酶活性降解了30~40%外模板時加入4種dNTP混合液，可獲得最隹標記效果。

3.  變雙鏈DNA的粘性末端成平端，便于平端克隆。在髙濃度4dNTP種存在下，酶促的 降解終止于雙鏈區，類似地，如果末端存在5‘凸出，酶將延伸凹進陷的3’端直至與5’端平齊。在實際應用中，DNA與T4 DNA聚合酶和濃度各100 μmol/l dNTP在溫育20 min。