常用的DNA連接酶有兩種：來自大腸桿菌的DNA連接酶和來自噬菌體的T4DNA連接酶。二者的作用機理類似。T4連接酶作用分三步：
(1) T4DNA連接酶與輔助 因子ATP形成酶－AMP復合物。
(2) 酶－AMP復合物結合到具有5’－磷酸基和3’－羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。
(3) 產生一個新的 磷酸二酯鍵，把缺口封起來.
