T7RNA聚合酶／啟動子表達實驗

載體

氨芐青霉素 卡那霉素 pGP 裂解緩沖液

培養箱 分光光度計 離心機

1.  將含有待表達基因的片段亞克隆于pT7-5、pT-6或pT7-7中，轉化一種標準大腸桿菌菌株，此菌株不應帶有可指導T7 RNA聚合酶合成的質粒。轉化物涂布于氨芐青霉素平皿，于37℃溫育培養過夜。

2.  挑取獨立的轉化菌落于LB/氨芐青霉素培養基中，37℃培養，通過小量制備方法獲得質粒DNA。以限制性酶譜分析確證基因正確插入與否。 
 

3.  從pGP1-2轉化大腸桿菌K38株涂布LB/卡那霉素平皿上，30℃下培養過夜（24 h）。挑取單個的轉化菌落于LB/卡那霉素培養基中，30℃培養。

4.  將一含有P_t7控制下的待表達基因的載體轉化入大腸桿菌K38/pGP1-2，于LB/卡那霉素培養基上生長（轉化期間細胞可經熱激處理），將轉化物涂布于LB/氨芐青霉素/卡那霉素平板上，30℃培養過夜。

5.  挑取含兩種質粒的大腸桿菌單菌落，接種于5 ml LB/氨芐青霉素/卡那霉素培養基中，30℃下培養過夜。

6.  按1：40比例稀釋1 ml 過夜培養物，30℃下于LB/氨芐青霉素/卡那霉素培養基中長數小時，直至OD₃₉₄≈0.4。

7.  速將溫度升高至42℃，繼續培養30 min，誘導T7 RNA聚合酶基因的表達。

8.  將培養溫度降至37℃，繼續溫育90 min 后，離心收集細胞。

9.  通SDS-聚丙烯酰胺電泳分析誘導產生的蛋白。將相當于1.0 ml 培養液中的細胞重懸于0.1 ml 裂解緩沖液中，100℃加熱5 min 后，立即將各樣本以每份20 μl 的量加到SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳。可取10 μl 細胞制備適當的細胞提取物檢測誘導后的酶活性。