3.臺式離心機最大能達到2,600×g的離心力,如果將離心時間延長到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。
疑難解答:
RNA抽提
每1 mg組織或1×106培養細胞預期的RNA產量
1.肝和脾,6—10μg
2.腎,3—4μg
3.骨骼肌和腦組織,1—1.5μg
4.胎盤,1-4μg
5.上皮細胞(1×106 cultured cells),8—15μg
6.纖維母細胞(1×106 cultured cells),5—7μg
"抽提得率低
1.樣品均化或裂解不完全。
2.終RNA不完全再溶解。
"A260/A280 比率 <1.65
1.在分光光度計測量前用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。
2.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。
3.勻漿化后樣品沒有在室溫下放置5分鐘。
4.分離的水樣層中污染有苯酚層。
5.終RNA沒有完全溶解。
"RNA降解
1.從動物體取下的組織沒有立即進行抽提或冰凍保存。
2.用于抽提的樣品,或抽提的RNA樣品保存于–5—–20°C,而不是存放于–60—–70°C。
3.細胞經胰酶消化而分散。
4.水溶液或試管污染有RNA酶。
5.用于瓊脂糖凝膠電泳的福爾馬林pH低于3.5。
"DNA污染
1.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。
2.用于抽提的樣品包含有機溶媒(例如,乙醇,DMSO),強緩沖液,或堿性溶液。
"蛋白多糖和多糖污染
下述的對RNA沉淀方法(步驟3)的改進能從抽提的RNA中移去復合污染。以勻漿化時每1 ml TRIZOL為例,在水樣層中加入0.25 ml異丙醇后再加入0.25 ml的高鹽溶液(0.8 M檸檬酸鈉和1.2 M NaCl)。將終溶液混勻,離心并繼續進行前述的抽提操作。改進后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。對于含有大量多糖的植物,要抽提其RNA將改進后的沉淀法和在最初勻漿化時多加一次離心(RNA 抽提指南,可選方案)合并使用是十分必要的。