TUNEL 法測凋亡操作步驟
一、TUNEL檢測原理
TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒是采用非同位素方法來檢測細胞在凋亡過程中DNA 的斷裂情況，可在原位快速準確地檢測單個凋亡細胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。
其原理是細胞凋亡發生時，內源性核酸酶激活，使DNA的雙鏈斷裂或一條鏈出現缺口，產生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）作用下，組織細胞原位DNA切口可被標記上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling），可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺（DAB）的存在下，顯示為棕色（過氧化物酶活性），特異準確地定位正在凋亡的細胞，在普通顯微鏡下即可觀察和計數凋亡細胞；由于正的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA 的斷裂，因而沒有3'-OH 形成，很少能夠被染色。
二、試劑盒組份
組 份 10 assays 25 assays 儲存條件
A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃
B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃
C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃
D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃
20×SSC 15 mL 38 mL 4 ℃
E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃
F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃
G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃
H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL 4 ℃
三、操作流程
1.操作流程概覽
2.細胞樣本制備
準備：
● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去離子水中，HCl調pH至7.4，加水定容至1L。
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇；
● 細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；
操作步驟：
1)經過實驗處理的細胞爬片或細胞涂片，自然晾干；
2)室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；
4)浸入細胞膜通透液中，室溫30sec~2min；
5)進行標記反應。
3.石蠟包埋組織切片預處理
準備：
● 石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；
● 蛋白酶K工作液：2 μL500×蛋白酶K + 998 μL PBS；
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇。
操作步驟：
1)石蠟包埋的組織切片按常規方法脫蠟至水；
2)PBS漂洗3×5min；
3)加入蛋白酶K工作液，37℃反應15~30min；PBS漂洗3×5min；
4)（選擇進行）室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；
5)浸入封閉液中，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min；
6)進行標記反應。
4.冰凍組織切片預處理
準備：
● 固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；
● 封閉液：3%H2O2溶于甲醇；
● 細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；
操作步驟：
1)冰凍切片浸入固定液，室溫固定10min；PBS漂洗3×5min；
2)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；
3)浸入通透液中，室溫30sec~2min；
4)進行標記反應。
5.陽性對照和陰性對照的準備
TUNEL檢測時需要設立陽性對照和陰性對照，以顯示實驗的客觀性和準確性。
1)陽性對照樣本的處理（選擇進行）
DNaseI反應液（用戶自備）： （10U-3000U DNase I；40mM Tris-HCl pH 7.9；
10 mM NaCl；6mM MgCl2；10mM CaCl2）
組織樣本經過蛋白酶K處理或者通透液處理，PBS浸洗后，加入100 μL DNaseI反應液，室溫孵育10~30min，用去離子水徹底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，進行標記反應。
2)陰性對照樣本的處理
在進行標記反應過程配制TdT酶反應液時，不加入TdT酶，其余步驟相同。
四、標記和顯色反應
以下操作在濕盒內進行。
1.預處理好的樣本經過PBS漂洗后，用濾紙輕輕吸去樣本周圍液體；
2.每個樣本滴加100 μL TdT酶反應液，于37＆#61616；C避光反應60min；
TdT酶反應液的準備（即用即配）：
成分 標準100 μL/片 切片數 總體積
Equilibration Buffer 98 μL × =
Biotinylated Nucleotide Mix 1 μL × =
TdT Enzyme 1 μL × =
陰性對照片不加TdT酶。
3.用去離子水按1：10稀釋20×SSC，進行終止反應，室溫15min；然后PBS漂洗3×5min；
4.浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；
5.滴加100 μL Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀釋為工作液），于37℃反應30~60min；
6.PBS漂洗3×5min；
7.滴加DAB顯色液：
成分 100 μL/片 切片數 總體積
20×DAB Substrate Buffer 5 × =
20×DAB Chromogen 5 × =
20×Hydrogen Peroxide 5 × =
ddH2O 85 × =
8.用去離子水漂洗數次；（選擇進行復染細胞核）；
9.中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。
注意事項：
1.PBS清洗后，請盡量去除PBS液體再進行下一步反應；
2.避免載波片上的樣本干燥造成實驗失敗；
3.TdT酶反應液應即用即配，在冰上進行，不宜長期保存；
4.復染細胞核可以用甲基綠染液（用戶自備）。
參照圖
來源：上海遠慕生物科技有限公司
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